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Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 13520 (2022) Citer cet article

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SMIFH2 est une petite molécule inhibitrice de la famille des formines de régulateurs du cytosquelette qui a été identifiée à l'origine dans un criblage pour la suppression de la polymérisation de l'actine induite par la formine Diaphanous 1 (mDia1) de souris. Malgré l'utilisation généralisée de ce composé, on ne sait pas si SMIFH2 inhibe toutes les formines humaines. De plus, la nature des interactions protéine/inhibiteur reste insaisissable. Nous avons dosé SMIFH2 contre des formines humaines représentant six des sept classes de mammifères et avons trouvé une activité inhibitrice contre toutes les formines testées. Nous avons synthétisé un panel de dérivés de SMIFH2 et constaté que, bien que de nombreuses altérations perturbent l'activité de SMIFH2, la substitution d'un groupe méthoxy donneur d'électrons à la place du brome ainsi que l'halogénation du cycle furane augmentent la puissance d'environ cinq fois. Semblables à SMIFH2, les dérivés actifs sont également des pan-inhibiteurs pour les formines testées. Ce résultat suggère que même si la puissance peut être améliorée, l'objectif de distinguer les domaines FH2 hautement conservés peut ne pas être réalisable en utilisant l'échafaudage SMIFH2.

Les membres de la famille des formines de régulateurs du cytosquelette sont associés à une grande variété de processus cellulaires eucaryotes essentiels1,2. Les formines varient dans leurs fonctions biochimiques, qui comprennent la nucléation des filaments d'actine, l'association processive avec les extrémités des filaments en croissance, le regroupement des filaments d'actine, la liaison/stabilisation des microtubules et la séparation des filaments d'actine (examiné par Chesarone et al.3). Ces fonctions sont généralement exécutées par les domaines d'homologie de la formine (FH) 1 et 2 dans la partie C-terminale de la protéine (Fig. 1B). Le domaine FH2 est conservé de la levure à l'homme4,5 et est un homodimère principalement α-hélicoïdal avec une architecture en forme de beignet qui encercle l'extrémité dynamique « barbelée » du filament d'actine6,7,8,9. Le domaine FH1 est une région riche en proline non structurée qui se lie à la profiline, une protéine de liaison aux monomères d'actine abondante10,11. Ensemble, ces domaines peuvent moduler la croissance des filaments d'actine12 et également déplacer d'autres protéines de liaison à l'extrémité barbelée13,14. Dans de nombreuses isoformes de formine, la région N-terminale contient des domaines régulateurs qui suppriment l'activité des domaines FH1 et FH215,16,17.

Constructions de formine et purification. (A) Arbre phylogénétique des formines basé sur DeWard et al.2 Pour doser diverses formines humaines, nous avons sélectionné des représentants de six des sept sous-classes de formines de mammifères. (B) Les constructions "FFC", qui incluent les domaines FH1 et FH2 et toutes les séquences C-terminales, ont été isolées pour chaque formine (DID, Diaphanous Inhibitory Domain ; DAD, Diaphanous Autoregulatory Domain). (C) SDS-PAGE montrant la pureté de chaque fragment FFC de formine recombinant après purification par coloration de Coomassie (voir la figure S7 pour le gel non recadré).

Le SMIFH2 (1-(3-bromophényl)-5-(furan-2-ylméthylène)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione) a été découvert lors d'un criblage in vitro de composés qui inhibent le domaine mDia FH2, d'où son nom Small Molecule Inhibitor of FH218. SMIFH2 est supposé être un inhibiteur de la pan-formine sur la base de données biochimiques montrant qu'il peut inhiber les formines de levure Bni1, Fus1 et Cdc12, la formine de nématode CYK-1 et la formine de souris DIAPH118. Des données plus récentes montrent des interactions de SMIFH2 avec des formines végétales, notamment Arabidopsis formin-119, entre autres. Cependant, l'hypothèse selon laquelle SMIFH2 est un pan-inhibiteur n'a jamais été testée in vitro pour divers domaines FH2 de mammifères. Pour sonder comment les formines contribuent aux processus cellulaires, les inhibiteurs pan ainsi que les inhibiteurs spécifiques sont utiles. Un inhibiteur spécifique à l'isoforme de la souris Dia1 et Dia2 mais pas de Dia3 a été rapporté, mais une faible solubilité dans les milieux de culture cellulaire a entravé son utilisation20.

Les inhibiteurs à petites molécules ont été inestimables dans l'étude de la fonction cytosquelettique. Ceux-ci incluent des composés de produits naturels qui agissent directement sur les filaments du cytosquelette21, ainsi que les composés principalement synthétiques qui ciblent les protéines de liaison du cytosquelette comme SMIFH2, l'inhibiteur Arp2/3 CK66622 et l'inhibiteur de la myosine blebbistatin et ses analogues23. En raison de l'importance de la régulation du cytosquelette médiée par la formine chez les eucaryotes, SMIFH2 a été utilisé dans au moins 324 études sur les rôles cellulaires des formines dans la construction des cytosquelettes d'actine et de microtubules (manuscrits originaux dans une recherche Google Scholar pour 'SMIFH2', mai 2022).

Dans le cadre de cette utilisation généralisée, plusieurs interactions SMIFH2 hors cible ont été rapportées : une avec le suppresseur de tumeur p5324 et une autre avec plusieurs membres de la superfamille des myosines25. Ce dernier est particulièrement préoccupant, étant donné que les formines et les myosines sont toutes deux des régulateurs du cytosquelette et que les effets induits par SMIFH2 sur le cytosquelette peuvent être difficiles à interpréter dans certains contextes. Étonnamment, SMIFH2 inhibe plus puissamment l'activité ATPase induite par l'actine de la myosine 5 de Drosophila (IC50 ≈ 2 µM) que les interactions formine/actine médiée (IC50 ≈ 10–20 µM)25. Ces interactions hors cible peuvent être liées au fait que SMIFH2 est classé comme un composé Pan Assay INterference (ou PAIN) en raison de l'électrophilie de son fragment dicarbonyl alkylidène α/β-insaturé26. L'utilisation généralisée et les inconvénients potentiels de SMIFH2 ont motivé la recherche d'analogues optimisés de SMIFH2 ou même d'une nouvelle génération d'inhibiteurs de la formine.

Dans cette étude, nous rapportons une étude structure-activité de SMIFH2 contre un panel de diverses formines humaines, en utilisant le test de polymérisation in vitro pyrène-actine27. Nous constatons que SMIFH2 est un pan-inhibiteur de ces formines humaines, et que les perturbations de sa structure modulent l'activité mais pas la spécificité.

SMIFH2 a été sélectionné dans une bibliothèque de molécules de type médicament pour sa capacité à inhiber la formine mDia1 de souris dans un essai de polymérisation pyrène-actine18. Nous avons utilisé le test de polymérisation pyrène-actine pour caractériser l'activité inhibitrice contre un panel de formines humaines représentant six des sept classes de formines de mammifères (Fig. 1A). Ces formines ont été exprimées de manière recombinante sous forme de fragments «FFC» constitutivement actifs (contenant les régions FH1, FH2 et C-terminale; Fig. 1B) et purifiées par chromatographie d'affinité (Fig. 1C).

SMIFH2 et ses analogues ont été synthétisés comme décrit dans les procédures expérimentales. Dans toutes les expériences de caractérisation RMN, il a été observé que SMIFH2 était un mélange d'isomères E et Z, avec un doublement de chaque pic de proton en raison des différents environnements dans chaque isomère. Dans certains cas, une distribution inégale des isomères a été observée immédiatement après la dissolution de SMIFH2, comme indiqué pour le solvant tétrahydrofurane deutéré (THF-d8) (Fig. 2). Après incubation à température ambiante pendant 20 h, cet échantillon s'est équilibré en un mélange 1:1 d'isomères, à en juger par les intégrations maximales équivalentes pour chaque paire. Le passage d'intégrations de pics inégales à égales indique que la constante d'équilibre du processus d'isomérisation est proche de 1 et que la molécule s'échange entre ces isomères sur une échelle de temps expérimentalement pertinente. D'après l'analyse RMN de SMIFH2 dans du diméthylsulfoxyde deutéré (DMSO-d8), le rapport initial des isomères était plus proche de 1: 1 que celui observé dans le THF-d8. Sur cette base, nous en déduisons que la cinétique d'équilibrage est plus rapide dans le DMSO-d8 que dans le THF-d8. Quel que soit le solvant, on ne peut pas dire à quel pic de chaque couple correspond quel isomère. De plus, on ne sait pas si les deux isomères ou un seul isomère inhibent le domaine FH2.

SMIFH2 est un mélange d'isomères qui s'équilibrent avec le temps. Les spectres RMN 1H du même échantillon ont été recueillis à deux moments. Le spectre bleu (en bas) correspond à l'échantillon SMIFH2 immédiatement après préparation dans le THF-d8. Les intégrations maximales inégales sont évidentes dans les signaux des protons A, B, C, D et E. Le rapport isomérique initial a été calculé comme étant de 3,5: 1 par intégration de la résonance majeure à 8, 25 ppm et de la résonance mineure à 8, 33 ppm pour le proton E. .1:1 par intégration des résonances à 8,33 ppm et 8,25 ppm).

Tous les fragments FFC étaient actifs dans les essais de polymérisation pyrène-actine, à en juger par leur capacité à stimuler l'assemblage par rapport au taux de référence d'actine / profiline seule (Fig. 3, comparant les courbes rouge et grise). Comme indiqué précédemment, les formines apparentées diaphanes (DIAPH1 et DIAPH2) et la formine inversée 2 (INF2) ont stimulé l'assemblage à de faibles concentrations nanomolaires (5 nM). FMNL3, FMN2 et DAAM2 avaient une efficacité de nucléation intermédiaire (polymérisation de l'actine induite par la formine de 20 à 25 nM, de sorte que l'état d'équilibre était atteint dans les années 2000), et la Delphiline (25 nM) avait une activité de nucléation assez faible, comme déjà signalé pour l'actine du muscle squelettique du lapin.

SMIFH2 a une large activité sur les formines humaines. Pour chaque titrage, la fluorescence du pyrène a été surveillée pour 2 μM d'actine (5 % marqué au pyrène) / 4 μM de profiline de S. pombe. La ligne pointillée noire montre la profiline/actine seule, et la trace rouge correspond à l'ajout de formine FFC à la profiline/actine (5 nM DIAPH1, DIAPH2, INF2 ; 20 nM FMNL3 ; 20 nM FMN2 ; 25 nM DAAM2 ; 25 nM Delphilin). L'augmentation de la concentration de SMIFH2 est indiquée par des traces bleues, avec la concentration µM marquée à droite de chaque parcelle. Le volume de DMSO ajouté était le même pour toutes les traces, quelle que soit la concentration de SMIFH2.

Pour caractériser la spécificité de SMIFH2, nous avons titré l'inhibiteur contre chaque formine purifiée, en contrôlant le volume de DMSO pour toutes les réactions de polymérisation (Fig. 3, comme indiqué par les traces bleues). Dans tous les cas, SMIFH2 avait une concentration pour une inhibition de 50 % (IC50) dans la plage de 10 à 20 μM. Ceci est comparable à la valeur rapportée de 15 µM pour la souris Dia118. Parmi les formines diaphanes, SMIFH2 a un effet plus puissant sur DIAPH2 (Dia3) que sur DIAPH1 (Dia1), une inversion de préférence notable par rapport à l'inhibiteur à base de quinoxaline rapporté par Higgs et ses collaborateurs (composé 2 dans Gauvin et al.)20.

Plusieurs analogues de SMIFH2 sont connus pour conserver ou perdre leur activité inhibitrice contre mDia118. Nous avons cherché à élargir cet ensemble de données pour caractériser plus largement les relations structure-activité dans le complexe SMIFH2/formine. Les 17 analogues présentés sur la figure 4 ont été synthétisés selon le schéma décrit dans les procédures expérimentales (figure 6) et caractérisés par RMN du proton (figure S8). Chaque inhibiteur a été testé pour une interaction potentielle avec l'actine en l'absence de formine (Figs. S3, S4). Aux concentrations les plus élevées testées, nous avons constaté que certains inhibiteurs avaient des effets modestes sur la polymérisation de l'actine 2 µM (Fig. S3). Ces effets étaient moins apparents en présence de profiline 4 µM (Fig. S4), ce qui indique que l'interaction profiline/actine peut masquer l'interaction inhibiteur ou supprimer la polymérisation d'un complexe potentiel actine/SMIFH2. Ce panel de 18 inhibiteurs a été testé contre cinq fragments de formine FFC (DIAPH1, DIAPH2, INF2, FMNL3 et FMN2) et les valeurs IC50 ont été mesurées (Fig. 4 et Tableau 1). Une tendance notable dans cet ensemble de données est que le manque de spécificité, noté ci-dessus pour SMIFH2 (Fig. 3), vaut pour ses analogues : aucune modification apportée à SMIFH2 n'a conduit à un inhibiteur sélectif, du moins parmi les cinq formines testées. En d'autres termes, les inhibiteurs actifs inhibaient toutes les formines et les inhibiteurs inactifs manquaient d'activité contre toutes les formines testées.

Données d'activité de structure pour SMIFH2 et 17 analogues testés contre cinq formines humaines. Chaque point de données individuel indique une valeur IC50 à partir d'un titrage d'inhibiteur dans le test d'assemblage pyrène-actine. La moyenne et l'écart type pour chaque paire formine/analogue sont indiqués dans le tableau 1. Conditions : actine 2 μM (marquée au pyrène à 5 %), profiline de S. pombe 4 μM, formine (DIAPH1-FFC 5 nM, DIAPH2-FFC 5 nM, INF2-FFC 5 nM, FMN2-FFC 20-37,5 nM, FMNL3-FFC 20 nM), inhibiteur à volume fixe de DMSO. En raison de sa faible solubilité, le composé 9 a été dissous dans du DMF. Comme nous ne pouvons pas mesurer de manière fiable les valeurs IC50 supérieures à 40 µM, ces points sont indiqués sur la ligne > 40 µM. Les valeurs IC50 individuelles sont répertoriées dans le tableau S1.

Les modifications du noyau thiobarbiturique étaient de deux types : alkylation ou arylation de N3 et remplacement du thiocarbonyle par un oxygène carbonyle (numérotation des atomes en gris dans la structure du tableau 1). Cette dernière substitution (5) a entraîné une perte complète de l'activité inhibitrice (Fig. 4 et Tableau 1), conformément aux données rapportées par Kovar et ses collaborateurs (composé 3 dans Rizvi et al.18). La méthylation (2) et l'arylation (4) du SMIFH2 N3 ont été bien tolérées, et l'analogue phényle N3 (4) avait une activité inhibitrice 3 à quatre fois plus puissante que le SMIFH2. De manière surprenante, l'analogue à substitution éthyle (3) n'avait aucune activité détectable. Ceci était inattendu puisque l'activité élevée du composé 4 a montré que la poche de liaison sur le domaine FH2 pouvait accueillir des substituants aussi grands qu'un cycle phényle. Une caractéristique déterminante des PAIN est les relations structure-activité non sensées26, et il est possible que les données d'activité pour les composés 2, 3 et 4 soient confondues par les autres facteurs en dehors du changement d'énergie libre associé à la liaison protéine/inhibiteur. La tolérance de SMIFH2 à la méthylation (2) et à l'arylation (4) de N3 soutient en outre un modèle dans lequel un tautomère carbonyle (tel qu'illustré dans le tableau 1), et non un thio énol ou un oxygène énol29,30, est la forme active de SMIFH2. L'activité des composés 2 et 4 indique également que le groupe -NH de SMIFH2 n'agit probablement pas comme donneur de liaison hydrogène dans la poche de liaison aux protéines.

Pendant ce temps, plusieurs altérations de la partie anneau furane de SMIFH2 ont eu un effet dramatique sur l'activité. Les analogues du pyrrole (6) et du thiophène (7) n'ont eu aucun effet inhibiteur détectable sur les formines testées. D'autre part, l'halogénation du cycle furane en position C5', soit avec Cl (15) ou Br (16), a été bien tolérée, tandis que la méthylation à cette même position (17) a aboli l'activité. Ceci est cohérent avec l'activité élevée d'un analogue avec un autre halogène (I) en position 5', rapportée par Kovar et ses collaborateurs (composé 2 dans Rizvi, et al.18). Nous avons synthétisé un analogue avec un lieur étendu entre le furane et les anneaux centraux. Ce composé (18) avait une activité modeste.

SMIFH2 a un Br en position méta du cycle N1 (position R2 dans le tableau 1). L'effet de l'élimination de ce Br a été exploré avec le composé 9, qui a montré une activité mesurable mais faible à minimale. Le composé 9 était faiblement soluble dans le DMSO et a dû être dissous dans du DMF pour les dosages. En plus de supprimer complètement le Br, nous avons constaté que le déplacement de ce Br vers la position para (8) maintenait ou augmentait légèrement l'activité inhibitrice. Nous nous sommes intéressés aux effets d'un groupe méthoxy sur le cycle N1, et nous avons réussi à synthétiser l'analogue para-méthoxy (10). Alors que le composé 10 avait une activité réduite par rapport au méta-Br (1) ou au para-Br (8) SMIFH2, la substitution du furane par Br ou Cl en position C5' (11 ou 12, respectivement) ou Br en position C4' (13) en plus du groupe N1 para-méthoxy phényle semblait avoir des effets synergiques. Cela a été le plus frappant avec le composé 12, l'inhibiteur le plus puissant de notre série de composés. L'inclusion de ces deux substitutions ensemble a diminué les valeurs d'IC50 de deux à neuf fois (en comparant les composés 1 et 12), en fonction de la formine. Par exemple, la CI50 contre INF2 a été réduite de 10 ± 5 µM pour SMIFH2 (1) à 2 ± 1 µM pour le composé 12. Contrairement à l'incorporation d'un halogène aux positions furane C4' ou C5' dans la série para-méthoxy (11, 12, 13), l'ajout d'un Cl au furane C5' (14) n'a pas augmenté la puissance par rapport au para-Br seul (8).

Pris ensemble, les données d'activité pour SMIFH2 et le panel de 17 analogues mettent en évidence deux composants essentiels de la structure SMIFH2 : le thiocarbonyle et le cycle furane. Nos résultats indiquent également que les dérivés de SMIFH2 maintiennent leur activité lorsque la structure est modifiée à la position N3 du thiobarbiturique ainsi qu'aux positions méta et para sur le cycle N1-phényle et aux positions 4' et 5' du cycle furane. Malgré la diversité chimique explorée dans cette étude, nous n'avons pas identifié d'inhibiteur de formine spécifique à l'isoforme. Un tel inhibiteur peut exister dans une autre région de l'espace chimique SMIFH2 non explorée ici, comme des substitutions ortho et/ou multiples sur le cycle N1-phényle ou des furanes attachés au carbone bêta à leur carbone 3', parmi de nombreuses autres modifications potentielles. Alternativement, le manque de spécificité parmi le panel de molécules de cette étude suggère qu'un inhibiteur plus spécifique peut nécessiter un échafaudage complètement différent du noyau thiobarbiturique de SMIFH2 afin de faire la distinction entre les domaines FH2 hautement conservés. Higgs et ses collaborateurs ont identifié un inhibiteur à base de quinoxalinone avec une spécificité parmi les formines diaphanes20, suggérant qu'un ciblage spécifique parmi les domaines FH2 est réalisable.

À ce jour, aucune donnée structurelle de résolution atomique n'est disponible pour SMIFH2 lié au domaine FH2, ce qui entrave la conception rationnelle des perturbations structurelles de l'inhibiteur. Cela contraste avec l'inhibiteur Arp2/3 CK66622, dont la structure cristalline aux rayons X a été utilisée comme point de départ pour les calculs de perturbation d'énergie libre afin d'optimiser les interactions inhibiteur/protéine31. Les analogues les plus puissants rapportés ici peuvent être des candidats pour des études structurales d'un complexe protéine/SMIFH2, en particulier avec la forme humaine DIAPH2 (orthologue de mDia3). Sur la base des valeurs d'IC50, l'analogue SMIFH2 12 peut avoir une plus grande affinité pour DIAPH2 que toutes les autres paires formine/inhibiteur mesurées, bien que cela doive être confirmé par des expériences d'équilibre.

À notre connaissance, on ne sait pas exactement où se situe SMIFH2 dans la taxonomie des inhibiteurs covalents/non covalents ou réversibles/irréversibles. Son motif dicarbonyle insaturé α/β est probablement un accepteur de Michael, qui réagirait avec les acides aminés nucléophiles, plaçant SMIFH2 dans la catégorie covalente32,33,34. La substitution de furane au niveau du carbone β de SMIFH2 suggère que l'ajout d'un groupe thiol pourrait être réversible35. Des composés similaires à SMIFH2 avec un noyau de thiobarbiturate modifié se sont avérés inhiber la tyrosinase de champignon de manière irréversible36, soit par modification covalente d'un résidu de site actif, soit par induction d'un mauvais repliement des protéines. Des études cellulaires avec SMIFH2 ont montré une inversion des effets de SMIFH2 après un lavage37,38,39. Cependant, on ne sait pas si cela est dû à la synthèse de nouvelles protéines ou à la dissociation du complexe SMIFH2/formine.

Motivés par le large éventail d'activités inhibitrices observées dans notre étude structure-activité (Fig. 4 et Tableau 1) et le potentiel de ciblage covalent par SMIFH2, nous avons utilisé la modélisation informatique pour explorer les différences de structure moléculaire et de réactivité parmi ce groupe de molécules. Nous avons utilisé des calculs de la théorie fonctionnelle de la densité gaussienne au niveau de la théorie et de l'ensemble de base B3LYP/6311G++ (d,p) pour optimiser la géométrie d'un sous-ensemble de dix molécules, sélectionnées en raison de leurs activités variables. La figure 5A montre leurs géométries optimisées dans l'eau pour les isomères E et Z. La géométrie optimisée n'était pas sensible à l'ensemble de base ou au solvant (Fig. S5). Dans l'ensemble, la forme moléculaire était similaire pour toutes les molécules, quelle que soit leur activité inhibitrice. Les angles de torsion des anneaux « périphériques » par rapport à l'anneau thiobarbiturique central étaient compris entre 89,9° et 91,5° pour la liaison reliant N1 de l'anneau central à l'équivalent du cycle Br-phényle de SMIFH2 et entre 179,5° et 180° pour la liaison reliant Cβ du thiobarbiturate α/β-insaturé à C2' du cycle furane.

Analyse informatique des dérivés de SMIFH2. (A) Géométries optimisées de SMIFH2 (1) et neuf analogues alignés dans PyMOL en fonction de la partie thiourée (N1-C2-N3) de chaque molécule. (B) Électrophilie globale tracée comme une différence par rapport à SMIFH2. (C) Énergie orbitale frontière tracée montrant l'écart entre le HOMO à plus faible énergie et le LUMO à plus haute énergie. (D) Différence des charges de Hirshfeld calculées pour les carbones SMIFH2 qui sont des sites potentiels d'addition nucléophile. Les carbones spécifiques sont indiqués par un point rouge dans la structure illustrée pour SMIFH2 (1). Pour les panneaux (B-D), les molécules moins actives sont indiquées par des barres gris clair et les molécules plus actives sont indiquées par des barres gris foncé. Toutes les structures, énergies et charges ont été calculées avec Gaussian (voir Procédures expérimentales pour les niveaux de théorie et les ensembles de base). Voir la figure S6 pour les valeurs brutes d'électrophilie et de charge.

Nous avons sondé le degré de réactivité de SMIFH2 et de ces neuf dérivés à l'aide d'un indice global d'électrophilie40, que nous avons calculé à partir d'énergies ponctuelles d'espèces neutres, anioniques et cationiques solvatées dans l'eau. Nous avons trouvé une tendance à une électrophilie plus élevée pour les inhibiteurs actifs (barres sombres sur la figure 5B). Cependant, au moins une molécule inactive (7), qui a un thiophène à la place du furane, a une valeur d'électrophilie légèrement supérieure à SMIFH2 (Fig. 5B). Cela indique que l'électrophilie peut être un déterminant, mais pas le seul déterminant, de l'activité. Conformément à une électrophilie plus élevée, les inhibiteurs actifs avaient également des écarts d'énergie HOMO / LUMO légèrement plus petits (Fig. 5C). Enfin, nous avons calculé les charges de Hirshfeld pour les carbones qui étaient des sites potentiels d'attaque nucléophile, à savoir les carbones carbonyles et le carbone en position β par rapport aux carbonyles. Ces charges n'étaient pas corrélées à l'activité (Fig. 5D). Dans l'ensemble, nos résultats de calcul indiquent que ces dérivés de SMIFH2 ont des géométries similaires et une variation d'électrophilie.

L'utilisation généralisée de SMIFH2 au cours de la décennie qui a suivi les travaux fondateurs de Kovar et de ses collaborateurs18 souligne la demande d'inhibiteurs de la forme à petites molécules. En plus de la recherche d'inhibiteurs spécifiques de la formine, des données récentes montrant l'activité de l'inhibiteur de la formine SMIFH2 sur les myosines25 ont motivé la recherche d'inhibiteurs de la formine avec des interactions hors cible minimales. Il sera intéressant de tester la série de molécules de cette étude pour l'inhibition de la myosine et de déterminer si la puissance contre les myosines et la puissance contre les formines sont corrélées. À l'avenir, une compréhension plus approfondie des mécanismes et de la spécificité des inhibiteurs à petites molécules ciblant la formine est importante pour comprendre les rôles des formines dans les cellules. Nous avons constaté que bien que de nombreuses altérations perturbent l'activité de SMIFH2, nous pouvions augmenter la puissance d'environ cinq fois. Cependant, nous n'avons pas réussi à augmenter la spécificité, ce qui suggère que même si la puissance peut être améliorée, il peut être difficile d'atteindre la spécificité parmi les domaines FH2 étroitement liés avec l'échafaudage SMIFH2.

Tous les fragments du gène FFC de la formine ont été sous-clonés dans un vecteur pET15b modifié avec une étiquette 6-histidine N-terminale, à l'exception de DIAPH1, qui avait une étiquette 6-histidine C-terminale. Plusieurs gènes humains ont été optimisés en codons pour E. coli et obtenus sous forme de blocs g auprès d'Integrated DNA Technologies. Les fragments FFC ont été définis avec les numéros d'acides aminés : DIAPH1 (Transomic BC117257, aa 549-1262 ; analogue à UniProt O60610-1, aa 558-1272), DIAPH2 (NP_009293 / UniProt O60879-2, aa 553-1096), FMNL3 (NP_001354764. 1 / UniProt Q8IVF7-1, aa 481-1028), FMN2 (NP_064450.3 / UniProt Q9NZ56-1, aa 1192-1722), Delphilin (NP_001138590 / UniProt A4D2P6-1, aa 744-1211), INF2 (NP_071934.3 / Uni Prot Q27J81-1, aa 469-1249) et DAAM2 (NP_001188356.1 / UniProt Q86T65-3, aa 486-1068). Les séquences complètes d'ADN et d'acides aminés sont incluses dans les informations complémentaires.

Les protéines FFC de formine ont été exprimées dans des cellules ROSETTA-DE3 E. coli (Novagen) en cultivant les cellules à 37 ° C dans Terrific Broth jusqu'à une densité optique de 0,5 à 1,0 à 600 nm, en réduisant la température à 18 ° C pendant 1 h, en ajoutant 250 μM d'isopropyl-bêta-D-thiogalactoside (IPTG) et en cultivant pendant la nuit (≈ 12–17 h) à 18 ° C avec agitation à 250 tr/min. Les cellules ont été récoltées, lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1 × et congelées rapidement avant d'être stockées à - 80 ° C.

Les cellules exprimant INF2-FFC ont été lysées dans un tampon de lyse Ni-NTA [NaCl 500 mM, NaPi 50 mM pH 7,5, acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) 1 mM, dithiothréitol (DTT) 1 mM] additionné de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) 1 mM, DNaseI 4 µg/mL (Sigma #DN25), 2000- cocktail d'inhibiteurs de protéase dilué au 1/2 (Sigma P8849). Les cellules ont été lysées par French Press puis centrifugées à 40 000 xg pendant 30 min. Le lysat clarifié a été passé sur une colonne HisTrap de 2 ml (Cytiva) et élué avec un tampon de lyse Ni – NTA additionné d'imidazole 500 mM. La protéine éluée a été filtrée sur gel sur une colonne Superdex75 16/600 (Cytiva) équilibrée avec un tampon SEC [NaCl 150 mM, HEPES 10 mM pH 7, EDTA 1 mM, tris(2-carboxyéthyl)phosphine 0,5 mM (TCEP)]. La pureté a été évaluée par SDS-PAGE, et la protéine a été congelée rapidement dans de l'azote liquide et stockée à – 80 °C.

Les cellules exprimant DAAM2-FFC ont été lysées, centrifugées et passées sur une colonne HisTrap comme décrit ci-dessus pour INF2. Les fractions pures ont été regroupées et le tampon échangé par la colonne PD10 (Cytiva) dans le tampon SEC avant la dialyse avec un tampon glycérol:SEC 1: 1 pendant la nuit. Les aliquotes ont été congelées et conservées à – 80 °C.

Les cellules exprimant DIAPH2-FFC ont été lysées par French Press dans un tampon de lyse Ni – NTA additionné de PMSF, de DNaseI et d'un cocktail d'inhibiteurs de protéase et centrifugées, comme décrit pour INF2. Les lysats clarifiés ont été nutés pendant 1 h à 4 ° C avec de la résine Ni – NTA (Thermo Sci). La résine a été lavée avec 25 volumes de colonne (CV) de tampon de lyse Ni – NTA et 25 CV de tampon de lyse Ni – NTA additionné d'imidazole 10 mM, avant d'être éluée avec un tampon de lyse additionné d'imidazole 500 mM. La protéine éluée a été échangée au tampon par la colonne PD10 dans du tampon S (NaCl 10 mM, PIPES 10 mM pH 6, 5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM). La protéine a été chargée sur une colonne échangeuse de cations SP-FF de 1 ml (Cytiva) et éluée avec un gradient de 10 à 500 mM de NaCl sur 30 CV. Les fractions sélectionnées ont été échangées dans un tampon SEC par une colonne PD10, puis dialysées dans un tampon glycérol: SEC 1: 1 pendant une nuit. Les aliquotes ont été congelées et conservées à –80 °C. Les cellules exprimant FMN2-FFC ont été lysées dans un tampon de lyse Ni – NTA à pH 6, 5 modifié. Le reste du protocole de purification était identique à celui décrit pour DIAPH2-FFC.

Les cellules exprimant FMNL3-FFC ont été lysées dans un tampon d'extraction TALON (NaCl 300 mM, NaPi 50 mM pH 8, 0, β-mercaptoéthanol (βME) 1 mM) additionné de PMSF 1 mM et de DNaseI 4 µg / ml. Après lyse et centrifugation comme décrit ci-dessus pour INF2-FFC, le surnageant a été nuté avec 1 ml de résine TALON (Takara) pendant 30 min à 4 ° C. La résine a été lavée avec un tampon d'extraction 25 CV TALON puis un tampon de lavage 25 CV TALON (NaCl 300 mM, NaPi 50 mM pH 7, βME 1 mM) avant d'éluer avec un tampon de lavage TALON additionné d'imidazole 200 mM. La protéine éluée a été dialysée contre NaPi 50 mM pH 7, NaCl 50 mM, DTT 1 mM et chargée sur une colonne échangeuse de cations SP-FF et éluée avec un gradient de NaCl 50 à 500 mM sur 30 CV. Les fractions ont été dialysées contre du tampon S, chargées sur une colonne SP-FF et éluées avec un gradient échelonné de 10 mM de NaCl à 500 mM de NaCl. Les fractions éluées ont été chargées sur une colonne Superdex200 10/300 (Cytiva) équilibrée avec un tampon SEC. Les fractions pures ont été congelées rapidement dans de l'azote liquide et stockées à – 80 °C. FMNL3 a également été purifié dans un protocole qui a sauté la première colonne SP-FF, et il n'y avait aucune différence d'activité ou de pureté.

Les cellules exprimant DIAPH1-FFC ont été lysées par un sonicateur à sonde dans un tampon d'extraction TALON additionné de PMSF et de DNaseI. La formine a été purifiée en utilisant la résine TALON comme décrit ci-dessus pour FMNL3-FFC. Les fractions éluées ont été dialysées contre du tampon Q (Tris 10 mM pH 8, DTT 1 mM) pendant une nuit avec 100 unités de thrombine pour cliver l'étiquette histidine C-terminale. La protéine clivée a été chargée sur une colonne échangeuse d'anions monoQ (Cytiva) et éluée avec un gradient de 0 à 500 mM de KCl sur 30 CV. Les fractions semi-pures ont été échangées avec un tampon dans un tampon d'extraction TALON à l'aide d'une colonne PD10 et incubées avec de la résine TALON pour éliminer les protéines non clivées. La fraction qui ne s'est pas liée au TALON a été recueillie et dialysée contre du tampon Q puis 1:1 glycérol: tampon Q. Il en résulte une version de DIAPH1-FFC qui est tronquée par ~ 10 à 20 résidus sur l'extrémité C-terminale, comme évalué par spectrométrie de masse MALDI (données non présentées).

La Delphiline-FFC a été purifiée comme décrit pour l'isoforme FFC humaine28. La profiline de Schizosaccharomyces pombe a été exprimée dans un plasmide pET dans des cellules BL21-DE3* et a été purifiée comme décrit41. Nous avons choisi cette isoforme de profiline car, par rapport aux autres profilines, son interaction avec l'actine est moins sensible à la modification de l'actine au niveau de Cys73442. L'actine a été purifiée à partir de muscle squelettique de lapin et marquée avec du pyrène-iodoacétamide comme décrit42. Pour l'actine marquée au pyrène, la concentration de pyrène a été calculée en utilisant un coefficient d'extinction de 21 978 M-1 cm-1 à 344 nm, et la concentration d'actine a été calculée en utilisant le facteur de correction de 0,127 à 290 nm ([actine] = (A290 - 0,127 × A344) × 38 μM). Les coefficients d'extinction des formines à 280 nm ont été calculés à l'aide d'Expasy ProtParam43 : DIAPH1 (22 920 M−1 cm−1), DIAPH2 (25 900 M−1 cm−1), FMNL3 (28 420 M−1 cm−1), FMN2 (36 900 M−1 cm−1), Delphilin (25 440 M−1 cm−1), INF2 (47,4 40 M-1 cm-1), et DAAM2 (29 910 M-1 cm-1).

Pour la préparation de SMIFH2 et de ses analogues (Fig. 6), des thiourées N-aryl-substituées (A, X = S, R' = H) ont été préparées par traitement des anilines correspondantes avec du thiocyanate d'ammonium dans un acide aqueux. Le cyanate de potassium a donné l'urée intermédiaire (A, X = O, R' = H) en route vers l'analogue 544. L'utilisation de l'isothiocyanate d'alkyle ou de phényle correspondant a fourni des dérivés N3-substitués (A, X = S, R' = Me, Et, Ph). La réaction des (thio)urées A avec du malonate de diéthyle et de l'éthylate de sodium dans une solution d'éthanol29 a formé le noyau d'acide thiobarbiturique des intermédiaires B. La synthèse de SMIFH2 et d'analogues (C) a été complétée par condensation de Knoevenagel avec une sélection d'aldéhydes45,46, soit dans des conditions de reflux standard, soit à l'aide d'un réacteur à micro-ondes. SMIFH2 et ses analogues se sont formés sous forme de mélanges d'isomères E/Z et ont été caractérisés par RMN 1H et, dans certains cas, RMN 13C et/ou HRMS. D'autres détails expérimentaux et données de caractérisation sont inclus dans les informations complémentaires.

Schéma de synthèse pour les analogues de SMIFH2.

Les dosages ont été effectués comme décrit47. L'actine du muscle squelettique de lapin (marquée au pyrène à 5%) a été incubée pendant 2 min à 25 ° C avec 200 μM d'EGTA et 50 μM de MgCl2 pour convertir la Ca-actine en Mg-actine. Lorsqu'il était inclus dans l'expérience, un rapport molaire de 2: 1 de profiline a été incubé avec de l'actine pendant 2 min à 25 ° C avant la conversion en Mg-actine. La polymérisation a été initiée en ajoutant un tampon de polymérisation (KMEH, concentration finale : HEPES 10 mM, pH 7,0, EGTA 1 mM, KCl 50 mM, MgCl2 1 mM). Avant de mélanger le KMEH avec l'actine, les formines puis l'inhibiteur dans le DMSO ou le DMF ont été ajoutés à ≤ 1 % du volume total. Enfin, ce mélange a été rapidement mélangé avec du Mg-actine, avec un temps mort d'environ 10 à 20 s avant la mesure. La fluorescence a été contrôlée toutes les 15 s à l'aide d'un TECAN F200 Pro avec λex = 360 ± 17 nm et λem = 415 ± 10 nm. Le même volume de solvant organique (DMSO ou DMF) a été ajouté à chaque puits quelle que soit la concentration d'inhibiteur.

Les isomères SMIFH2 et leurs analogues chimiques ont été construits à l'aide du programme Avogadro48. Tous les calculs de mécanique quantique ont été effectués à l'aide de Gaussian 16 (versions A-2016 et C-2019)49. Les optimisations géométriques, l'énergie ponctuelle et les calculs de population de Hirshfeld ont été effectués avec la fonctionnelle B3LYP non restreinte (U) avec l'ensemble de base 6–311 + G(d,p)50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. Pour les optimisations géométriques, le mot-clé opt a été défini sur l'option 'tight' pour assurer une convergence adéquate. L'optimisation initiale pour tous les composés a été effectuée sous vide et utilisée ultérieurement pour les calculs solvatés rapportés dans cette étude. Des calculs d'énergie ponctuelle, pour une analyse d'électrophilicité globale, aux états neutre, anionique et cationique ont été effectués avec la fonction PW6B95 sans restriction (U) complétée par la fonction diffuse empirique D3 de Grimme et al. et l'ensemble de base aug-cc-pVTZ63,64,65,66,67. Le modèle de continuum polarisable SCRF (PCM) a été utilisé pour modéliser une eau implicite comme solvant. Les géométries optimisées ont été visualisées à l'aide de PyMOL68.

Pour calculer l'électrophilie globale (ω), nous avons utilisé la convention de Parr et al. ω = µ2/(2η) où µ et η représentent respectivement le potentiel chimique électronique et la dureté chimique40,69,70,71,72. L'énergie d'ionisation et l'affinité électronique ont été utilisées pour calculer µ et η, telles que définies par De Vleeschouwer et al.

Les données de caractérisation des composés synthétisés dans cette étude sont incluses dans les informations complémentaires. Les données utilisées pour calculer les moyennes du tableau 1 sont répertoriées dans le tableau S1. Des ensembles de données supplémentaires générés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Les auteurs reconnaissent le travail des étudiants du Laboratoire de synthèse chimique avancée (Amber Scharnow, Anna Yusov, Jacqueline Chou, Karen Montero, Karol Francisco, Kelsey Lynch, Kiana Harris, Lina Davidson, Maria Paley, Tahrima Jalil, Aisha Hasan, Amanda Sosnowski, Andromeda Urquilla, Choi Mak, Emeline Nguyenduy, Isabel Klein, Jenny Lam, Rachel Dziatko, Ataa Amponsah, Elizabeth Witta, Erica Christensen, Hannah Wentz, Irene Golden, Isabelle Rocroi, Rafaela Brinn, Alaina Hartnett, Allison Forsberg, Anna Hurdle, Emily Latif, Geneviève Nemeth, Janine Sempel, Jessica Glynn, Lucy Zorzano, Shoshana Williams, Tasneem Elkoush, Wendy Xie, Dominique Macaluso, Emily Miura-Stempel, Erika Amemiya, Isabel Hernandez-Rodriguez, Jennifer Niola, Juliet Lee, Kalina Ko, Maya Hoffman, Michelle Lin, Natasha Reich). Dina Merrer, Marisa Buzzeo et Dalibor Sames pour une discussion utile, Rabina Lakha pour la purification de l'actine, Grace Nickel pour son aide en biologie moléculaire.

Ce travail a été soutenu par la Research Corporation for Scientific Advancement (prix Cottrell # 25929 à CLV), Barnard College et XSEDE (attribution # MCB200054 à CLV). Le spectromètre RMN a été soutenu par la NSF Division of Chemistry (prix IRM #1827936).

Département de chimie, Barnard College, New York, NY, États-Unis

Marina Orman, Maya Landis, Aisha Oza, Deepika Nambiar, Joana Gjeci, Kristen Song, Vivian Huang, Amanda Klestzick, Carla Hachicho, Su Qing Liu, Judith M. Kamm, Jean J. Vadakkan, Christian M. Rojas et Christina L. Vizcarra

Département de pathologie et de biologie cellulaire, Columbia University Medical Center, New York, NY, États-Unis

Frances Bartolini

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MO, ML, DN, JG, KS, VH, AK, CH, SQL, JMK, JJK, CMR et CLV ont acquis et analysé des données. AO et JMK ont effectué une analyse informatique. Expériences conçues par MO, SQL, JMK, FB, JJK, CMR et CLV. AO, DN, JG, FB, CMR et CLV ont préparé le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Christina L. Vizcarra.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Orman, M., Landis, M., Oza, A. et al. Les altérations de l'inhibiteur de formine à large spectre SMIFH2 modulent la puissance mais pas la spécificité. Sci Rep 12, 13520 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17685-z

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Reçu : 04 juin 2022

Accepté : 29 juillet 2022

Publié: 08 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-17685-z

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