Cerveau

Nature volume 609, pages 822–828 (2022)Citer cet article

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L'engagement de médicaments sur la cible et hors des tissus est une source importante d'effets indésirables qui limite la fenêtre thérapeutique des candidats-médicaments1,2. Dans les maladies du système nerveux central, les médicaments à pharmacologie restreinte au cerveau sont hautement souhaitables. Nous rapportons ici une stratégie pour obtenir l'inhibition de la cible mammifère de la rapamycine (mTOR) tout en épargnant l'activité de mTOR ailleurs grâce à l'utilisation de l'inhibiteur mTOR perméable au cerveau RapaLink-1 et du ligand FKBP12 RapaBlock imperméable au cerveau. Nous montrons que cette combinaison de médicaments atténue les effets systémiques des inhibiteurs de mTOR mais conserve l'efficacité de RapaLink-1 dans les xénogreffes de glioblastome. Nous présentons en outre une méthode générale pour concevoir des inhibiteurs de kinase perméables aux cellules et dépendants de FKBP12 à partir d'échafaudages de médicaments connus. Ces inhibiteurs sont sensibles à la désactivation par RapaBlock, permettant l'inhibition restreinte au cerveau de leurs cibles kinases respectives.

L'administration d'un médicament à petite molécule entraîne souvent des effets pharmacologiques systémiques qui contribuent à la fois à l'efficacité et à la toxicité et définissent son index thérapeutique. Bien que les effets hors cible puissent être atténués par des modifications chimiques qui améliorent la spécificité du médicament, la toxicité sur cible et hors tissu représente un défi unique qui nécessite un contrôle précis de la partition tissulaire. Les toxicités sur cible et hors tissu affectent les médicaments couramment utilisés tels que les statines (myopathie causée par l'inhibition de la HMG CoA réductase dans le muscle squelettique)1 et les antihistaminiques de première génération (somnolence causée par le blocage du récepteur H1 dans le cerveau)2 et peuvent parfois empêcher l'utilisation sûre d'agents thérapeutiques par ailleurs efficaces. Les inhibiteurs chimiques de mTOR en sont un bon exemple. Bien que les inhibiteurs allostériques et orthostériques de mTOR aient été étudiés dans de nombreuses maladies du système nerveux central (SNC), y compris le complexe de sclérose tubéreuse3,4,5, le glioblastome6,7,8,9 et les troubles liés à la consommation d'alcool10,11,12, l'inhibition systémique de mTOR est associée à divers effets indésirables limitant la dose : suppression immunitaire, troubles métaboliques et inhibition de la croissance chez les enfants13,14. Si les effets pharmacologiques de ces inhibiteurs de mTOR pouvaient être confinés au SNC, leur fenêtre thérapeutique pourrait être considérablement élargie. Nous présentons ici une stratégie chimique qui permet l'inhibition de mTOR spécifique au cerveau grâce à la combinaison de deux agents pharmacologiques : un inhibiteur de mTOR perméable au cerveau (RapaLink-1) dont la fonction nécessite la protéine intracellulaire FK506-binding protein 12 (FKBP12) et un ligand imperméable au cerveau de FKBP12 (RapaBlock). Lorsqu'elle est utilisée dans un modèle de xénogreffe de glioblastome, cette combinaison de médicaments a entraîné une régression tumorale sans toxicité systémique détectable. Nous démontrons en outre que cette stratégie peut être adaptée pour obtenir une inhibition spécifique du cerveau d'autres cibles de kinase en développant une méthode pour convertir les inhibiteurs de kinase connus en formats dépendants de FKBP12.

Le ciblage thérapeutique de la mTOR kinase peut être réalisé à la fois allostériquement et orthostériquement. Les inhibiteurs de mTOR de première génération, la rapamycine et ses analogues (rapalogues), se lient au domaine de liaison à la rapamycine (FRB) FK506 de mTOR en tant que complexe avec la protéine intracellulaire FKBP12, entraînant une inhibition allostérique dépendante du substrat du complexe mTOR 1 (réf. 15,16,17). Les inhibiteurs de la mTOR kinase de deuxième génération (TORKi) se lient directement dans la poche ATP de mTOR et inhibent l'activité à la fois du complexe mTOR 1 et du complexe 2 (réf. 18, 19, 20). L'inhibiteur de mTOR de troisième génération RapaLink-1 est un ligand bitopique qui engage simultanément la poche ATP et une poche allostérique (le domaine FRB) de mTOR, réalisant une inhibition puissante et durable de son activité kinase21. Malgré son poids moléculaire élevé (1 784 Da), RapaLink-1 pénètre les cellules et le cerveau et a montré une efficacité in vivo accrue dans la conduite de la régression du glioblastome par rapport aux inhibiteurs mTOR antérieurs7.

Parce que RapaLink-1 contient un fragment inhibiteur de TOR kinase (TORKi) (Fig. 1a, ombrage gris) qui se lie dans la poche ATP, nous nous sommes demandé si l'interaction de RapaLink-1 avec FKBP12 est essentielle pour son inhibition de mTOR. Nous avons effectué des tests de kinase in vitro avec la protéine mTOR purifiée et avons constaté que RapaLink-1 présentait des valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) identiques à celles de MLN0128 (la partie TORKi de RapaLink-1), que FKBP12 soit présent (Fig. 1b), indiquant que RapaLink-1 peut engager le site actif de mTOR indépendamment de FKBP12 dans un environnement sans cellule. Cependant, lorsque nous avons testé RapaLink-1 dans des cellules, nous avons observé une forte dépendance à FKBP12 pour l'inhibition de mTOR. Dans les cellules K562 exprimant dCas9-KRAB, l'inactivation médiée par CRISPRi du gène codant pour FKBP12 avec deux ARN à guide unique (ARNsg) distincts a considérablement entravé son activité cellulaire (Fig. 1c). Cet effet était encore plus prononcé lorsque nous avons utilisé FK506 (un ligand naturel de haute affinité de FKBP12) pour bloquer pharmacologiquement le site de liaison du ligand de FKBP12. Une dépendance FKBP12 similaire de RapaLink-1 a été observée lorsque nous avons surveillé la signalisation mTOR par Western blot (Fig. 1d ; voir également réf. 21). Alors que RapaLink-1 10 nM a réduit le phospho-S6 (S240/244) et le phospho-4EBP (T37/46) à des niveaux presque indétectables, la combinaison de RapaLink-1 10 nM et de FK506 10 µM n'a montré aucun effet sur les deux marqueurs.

a, Structures chimiques de RapaLink-1 et FK506. b, inhibition de l'activité mTOR par MLN128, RapaLink-1 ou la rapamycine en présence ou en l'absence de 10 µM de FKBP12 dans le test de kinase in vitro (n = 2 ; les données sont tracées sous forme de points individuels). c, les cellules K562 CRISPRi transduites avec des sgARN ciblant GAL4-4 (contrôle) ou FKBP12 ont été traitées avec RapaLink-1 et la prolifération cellulaire a été évaluée après 72 h. Dans la dernière condition répertoriée, les cellules ont été transduites avec du sgRNA mais traitées avec RapaLink-1 en présence de 10 µM de FK506 (n = 3). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd d, analyse par immunoblot de la signalisation mTOR dans les cellules MCF7 traitées avec du DMSO, RapaLink-1, FK506 ou une combinaison de RapaLink-1 et FK506. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes. L'actine était le contrôle de charge. Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire. MW, poids moléculaire. e, Schémas du modèle de travail proposé. Les cercles gris indiquent les membranes cellulaires.

Données source

Ces résultats mettent en évidence que bien que FKBP12 ne soit pas essentiel pour que RapaLink-1 se lie et inhibe le site actif de mTOR in vitro, il est nécessaire à l'activité cellulaire, servant probablement de puits intracellulaire pour que RapaLink-1 s'accumule dans la cellule. Nous avons sondé cette possibilité en utilisant un analogue structurel de RapaLink-1, dans lequel le fragment TORKi avait été remplacé par de la tétraméthylrhodamine (RapaTAMRA; Extended Data Fig. 1). Cet analogue fluorescent de RapaLink-1 nous a permis de quantifier la concentration de composés intracellulaires par cytométrie en flux. Conformément aux découvertes précédentes avec RapaLink-1 (réf. 21) et d'autres composés de liaison au FKBP22,23, RapaTAMRA a montré une rétention cellulaire élevée (multiplication par dix de l'intensité médiane de la fluorescence) même après un lessivage important, mais cet effet a été atténué par l'inactivation du gène codant pour FKBP12 (Données étendues Fig. 1c). Bien que d'autres facteurs puissent y contribuer, nos données suggèrent que la partition cellulaire médiée par FKBP12 joue un rôle important dans la puissance exceptionnelle de RapaLink-1.

Nous avons ensuite examiné si la dépendance de RapaLink-1 à FKBP12 pouvait être exploitée pour obtenir une inhibition de mTOR restreinte au SNC. Plus précisément, le blocage sélectif de FKBP12 dans les tissus périphériques avec un puissant ligand de petite molécule imperméable au cerveau permettrait à RapaLink de s'accumuler dans le cerveau mais pas dans les tissus périphériques, entraînant une inhibition spécifique au cerveau (Fig. 2a). Pour identifier un ligand candidat FKBP12 avec le profil de perméabilité approprié (c'est-à-dire perméable aux cellules mais imperméable à la barrière hémato-encéphalique (BBB)), nous avons considéré des ligands FKBP12 naturels et synthétiques connus de haute affinité (par exemple, FK506 (réfs. 24,25), rapamycine26,27 et SLF/Shield-1 (réfs. 28,29)), mais tous ces composés traversent facilement la BBB. Par conséquent, nous avons synthétisé un panel de dérivés de SLF et de FK506 dans lesquels des substituants polaires (en particulier des donneurs et des accepteurs de liaisons hydrogène) avaient été attachés aux parties exposées au solvant de ces deux molécules, s'opposant directement aux règles empiriques de conception de médicaments perméables à la BBB30,31 (Extended Data Fig. 2). De plus, la modification de l'allyle C21 de FK506 présente l'avantage supplémentaire de supprimer la liaison à la calcineurine32, la cible naturelle de FK506, dont l'inhibition provoque la suppression de la signalisation du facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) et donc l'immunosuppression (Fig. 2b). La majorité des dérivés de Shield-1 et FK506 que nous avons synthétisés ont maintenu une liaison puissante à FKBP12 (Extended Data Fig. 2), telle que mesurée par un test de polarisation de fluorescence compétitive33. Nous avons ensuite criblé ces composés (10 µM) dans un test cellulaire, évaluant s'ils peuvent protéger mTOR de l'inhibition par RapaLink-1 (10 nM) en surveillant le niveau de phospho-S6 par western blot. Bien que certains des dérivés de SLF aient atténué la puissance de la rapamycine (sauvant les niveaux de phospho-S6), ils n'ont pas réussi à bloquer RapaLink-1 (Extended Data Fig. 2a). Pendant ce temps, la plupart des analogues du FK506 étaient efficaces, certains d'entre eux empêchant complètement RapaLink-1 d'inhiber mTOR (Extended Data Fig. 2b). Cela est probablement dû à la plus faible affinité des dérivés SLF que FKBP12, conformément à nos résultats de modélisation informatique (voir la note complémentaire 1 pour plus de détails). Nous avons soumis quatre composés avec des chémotypes de chaîne latérale distincts à un criblage in vivo supplémentaire, dans lequel la signalisation mTOR a été analysée séparément dans le cerveau et les tissus musculaires squelettiques de souris traitées avec une combinaison de RapaLink-1 et du composé candidat (1 et 40 mg par kg, respectivement). Un dérivé de pyridine N-oxyde de FK506 (06-041) protégeait les tissus périphériques de RapaLink-1 mais permettait une puissante inhibition de mTOR dans le cerveau (Extended Data Fig. 3). Nous avons donc choisi ce composé pour une étude plus approfondie et l'appelons «RapaBlock» (Fig. 2c).

a, Modèle proposé pour obtenir une inhibition de mTOR spécifique au cerveau grâce à la combinaison d'un inhibiteur de mTOR dépendant de FKBP12 (RapaLink-1) et d'un ligand FKBP12 imperméable au cerveau (RapaBlock). b, structure co-cristalline FK506 – FKBP12 (PDB: 1FKJ) montrant que le groupe allyle C21 est exposé au solvant et que sa modification peut conduire à l'abolition de la liaison à la calcineurine. c, structure chimique de RapaBlock. La zone ombragée en bleu indique la fraction de liaison à FKBP12. La partie violette indique la modification chimique par rapport au FK506. d, test de polarisation de fluorescence de compétition utilisant de la rapamycine marquée à la fluorescéine comme composé traceur (n = 2 ; les données sont présentées sous forme de points individuels). e, les cellules Jurkat exprimant une luciférase sous le contrôle de l'élément de réponse à la transcription NFAT ont été stimulées avec de l'acétate de myristate de phorbol et de l'ionomycine en présence de diverses concentrations de composés (n = 3; les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd).

Données source

RapaBlock et FK506 se lient à FKBP12 avec une affinité comparable (Fig. 2d ; constante d'inhibition (Ki) : 3,1 nM et 1,7 nM, respectivement), mais contrairement à FK506, RapaBlock ne présente aucune activité inhibitrice pour la calcineurine (Fig. 2e). Dans les cellules en culture, RapaBlock n'affecte pas la signalisation mTOR par lui-même (jusqu'à 10 µM) mais atténue les effets pharmacologiques de RapaLink-1 de manière dose-dépendante (Fig. 3a). RapaBlock semble plus efficace pour bloquer la rapamycine, restaurant le signal phospho-S6 au même niveau que les cellules non traitées à une stoechiométrie de 100: 1 (Fig. 3d). La haute affinité de RapaBlock pour FKBP12 est cruciale pour son activité bloquante - un analogue structurel de RapaBlock avec une liaison 100 fois réduite à FKBP12 n'a pas réussi à sauver l'inhibition de mTOR par RapaLink-1 (Extended Data Fig. 4).

a, d, les cellules MCF7 ont été traitées avec une combinaison de RapaLink-1 et de RapaBlock (a), ou de rapamycine et de RapaBlock (d) pendant 4 h, puis la phosphorylation des substrats mTOR a été analysée par immunotransfert. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes. GDPDH a été utilisé comme contrôle de chargement. Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire. b, e, les PBMC humains ont été stimulés avec des anti-CD3 et anti-CD28 en présence de quantités variables de RapaLink-1 et RapaBlock (b) ou de rapamycine et RapaBlock (e), et la prolifération cellulaire a été mesurée après 120 h (n = 3; les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd). c, f, La sécrétion d'IL-2 dans le surnageant de culture de PBMC stimulées avec anti-CD3 et anti-CD28 et traitées avec Rapalink-1 (c) ou rapamycine (f) a été quantifiée par ELISA sandwich (n = 3 ; les données sont présentées en moyenne ± sd).

Données source

En raison du rôle important de la signalisation mTOR dans la croissance cellulaire34, nous avons demandé si RapaBlock pouvait empêcher la suppression médiée par RapaLink-1 de la prolifération des lymphocytes T in vitro. Nous avons stimulé les cellules sanguines mononucléaires périphériques humaines (PBMC) avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 en présence de différentes concentrations de RapaLink-1 et RapaBlock et évalué la prolifération cellulaire après 5 jours. Alors que RapaLink-1 inhibait puissamment la prolifération des PBMC à des concentrations nanomolaires, l'ajout de RapaBlock a aboli cet effet, décalant l'IC50 de plus de 100 fois (Fig. 3b). Nous avons également observé une libération cumulative d'IL-2 plus élevée dans les cellules co-traitées avec RapaLink-1 et RapaBlock que dans les cellules traitées avec RapaLink-1 seul (Fig. 3c). Conformément à notre observation de la signalisation mTOR, RapaBlock est apparu plus efficace pour protéger les PBMC de l'inhibition de la croissance médiée par la rapamycine (Fig. 3e, f). Ensemble, ces données démontrent qu'en se liant de manière compétitive au FKBP12 intracellulaire, RapaBlock rend RapaLink-1 et la rapamycine incapables d'inhiber mTOR.

Pour examiner si la combinaison de RapaLink-1 et RapaBlock permet une inhibition spécifique du cerveau de mTOR in vivo, nous avons traité des souris BALB/cnu/nu saines avec RapaLink-1 (1 mg par kg) ou une combinaison de RapaLink-1 (1 mg par kg) et RapaBlock (40 mg par kg), stimulé l'activité mTOR avec de l'insuline (250 mU) après 4 h ou 24 h, et analysé les tissus disséqués par immunoblot (Fig. 4a et Extended Données Fig. 5). RapaLink-1, lorsqu'il est utilisé en tant qu'agent unique, a puissamment inhibé la signalisation mTOR dans les muscles squelettiques et les tissus cérébraux, comme l'a révélé la phosphorylation réduite de S6 et 4EBP1. Cependant, la combinaison de RapaLink-1 et de RapaBlock a montré des effets remarquables spécifiques aux tissus ; bien que l'activité mTOR dans le cerveau ait été inhibée à un niveau comparable à celui des souris traitées avec RapaLink-1 uniquement, l'activité mTOR dans le muscle squelettique n'a pas été inhibée. Cette spécificité tissulaire nous a permis d'inhiber l'activité de mTOR dans le cerveau de la souris dans le cadre de traitements chroniques sans les effets secondaires courants des inhibiteurs de mTOR, tels que la perte de poids corporel, l'altération du métabolisme du glucose et la toxicité hépatique35.

a, Analyse de la signalisation mTOR dans le cerveau entier et le muscle squelettique de la souris après une dose unique de RapaLink-1 (1 mg par kg), RapaBlock (40 mg par kg) ou une combinaison des deux. Les intensités quantifiées sont indiquées sous chaque immunotransfert lorsque le facteur augmente par rapport au muscle ou au cerveau sans stimulation par l'insuline, normalisé à GAPDH (n = 3 ; les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type). Des tests statistiques ont été effectués entre les groupes de traitement RapaLink-1 et RapaLink-1 + RapaBlock à chaque instant (test t de Student bilatéral non apparié). Les images d'immunoblot sont présentées pour un animal de chaque groupe. Voir Extended Data Fig. 5 pour les autres répétitions. Tous les échantillons sont issus de la même expérience. Les gels et les transferts ont été traités en parallèle. GAPDH était le contrôle de chargement. Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1. b supplémentaire. Des souris (n = 7) portant des xénogreffes de glioblastome orthotopique exprimant la luciférase (U87MG) ont été traitées par voie intrapéritonéale tous les 5 jours avec : (1) véhicule ; (2) RapaBlock (40 mg par kg); (3) RapaLink-1 (1 mg par kg); et (4) RapaLink-1 (1 mg par kg) et RapaBlock (40 mg par kg). La taille de la tumeur et le poids de la souris ont été surveillés tous les 5 jours à l'aide de l'imagerie par bioluminescence. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type. Des tests statistiques ont été effectués pour chaque groupe de traitement par rapport au groupe traité par le véhicule : test t de Student bilatéral non apparié (taille de la tumeur au jour 20) et test du log-rank (survie). c, Des souris (n = 5) porteuses de xénogreffes de glioblastome orthotopique exprimant la luciférase (GBM43) ont été traitées par voie intrapéritonéale tous les 5 jours avec : (1) véhicule ; (2) RapaBlock (60 mg par kg); (3) RapaLink-1 (1,2 mg par kg); et (4) RapaLink-1 (1,2 mg par kg) et RapaBlock (60 mg par kg). La taille de la tumeur et le poids de la souris ont été surveillés tous les 3 jours à l'aide de l'imagerie par bioluminescence. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type. Des tests statistiques ont été effectués pour chaque groupe de traitement par rapport au groupe traité par le véhicule : test t de Student bilatéral non apparié (taille de la tumeur au jour 10) et test du log-rank (survie). NS, non significatif.

Données source

RapaLink-1 s'est avéré efficace dans des modèles murins orthotopiques de glioblastome, mais l'inhibition de mTOR à la périphérie ne contribue pas à l'efficacité. Nous avons demandé si notre régime combiné, dépourvu de la capacité d'inhiber l'activité de mTOR dans les tissus périphériques, pouvait conserver l'efficacité de RapaLink-1 dans le traitement du glioblastome. Nous avons établi des xénogreffes intracrâniennes orthotopiques de cellules U87MG exprimant la luciférase de luciole chez des souris nues et avons traité ces souris avec des injections intrapéritonéales de RapaLink-1 (1 mg par kg), RapaBlock (40 mg par kg) ou une combinaison des deux tous les 5 jours. Tous les traitements ont été bien tolérés et aucun changement significatif du poids corporel n'a été observé (Fig. 4b et Extended Data Fig. 6a). RapaLink-1, à la fois en tant qu'agent unique ou en association avec RapaBlock, a significativement supprimé la croissance tumorale et amélioré la survie, alors que RapaBlock seul n'a eu aucun effet significatif sur l'un ou l'autre. Nous avons ensuite testé notre stratégie de traitement chez des souris avec des xénogreffes intracrâniennes de GBM43, un modèle de glioblastome dérivé de patients très agressif36. Bien qu'aucune des conditions n'ait supprimé la croissance rapide des tumeurs, la combinaison de RapaLink-1 (1,2 mg par kg) et de RapaBlock (60 mg par kg) a conféré un avantage en termes de survie (Fig. 4c et Extended Data Fig. 6b).

Après avoir établi une approche thérapeutique binaire pour obtenir une inhibition spécifique du cerveau de mTOR, nous nous sommes demandé si la même stratégie pouvait être adaptée à d'autres médicaments pour lesquels une pharmacologie restreinte au cerveau serait souhaitable. Un défi critique est que pour que cette approche soit généralisable, le composant "actif" (par exemple, RapaLink-1) doit dépendre de la disponibilité de FKBP12. Les médicaments ayant cette propriété sont rares ; peu, le cas échéant en dehors de la rapamycine et du FK506, sont connus. Notre enquête antérieure sur RapaLink-1 (Fig. 1) et RapaTAMRA (Extended Data Fig. 1) nous a conduits à émettre l'hypothèse que d'autres molécules bifonctionnelles constituées d'un fragment de liaison à FKBP12 et d'un fragment inhibiteur de kinase pourraient être conditionnellement actives et susceptibles d'être modulées avec RapaBlock.

Nous avons d'abord testé notre hypothèse avec le GNE7915, un inhibiteur puissant et spécifique de la leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) en cours d'investigation préclinique pour le traitement de la maladie de Parkinson37. Comme les mutations de gain de fonction de LRRK2 sont fortement associées aux formes héréditaires et sporadiques de la maladie de Parkinson, l'inhibition de la kinase LRRK2 a été poursuivie comme stratégie thérapeutique potentielle38,39. Cependant, des études récentes démontrant que l'inhibition systémique de LRRK2 avec des inhibiteurs à petites molécules induisaient une vacuolisation cytoplasmique des pneumocytes de type II ont suggéré un risque potentiel pour la sécurité de ces composés40,41. Nous avons synthétisé FK-GNE7915 en liant chimiquement les pharmacophores de FK506 et GNE7915 avec un groupe pipérazine (Fig. 5a). Dans les tests in vitro de la kinase LRRK2, le FK-GNE7915 était un inhibiteur inférieur au GNE7915 (Fig. 5c; IC50 de 107 nM et 3,0 nM, respectivement), bien que son activité ait été potentialisée en incluant 10 µM de FKBP12 dans le test (IC50 de 21 nM). Cependant, dans un essai cellulaire dans lequel nous avons quantifié les niveaux de phospho-LRRK2 (S935) en tant que marqueur de l'inhibition de LRRK2, FK-GNE7915 était plus puissant que le composé parent GNE7915 de plus de dix fois (Fig. 5d ; IC50 de 6,7 nM et 81 nM, respectivement). La juxtaposition de ces deux résultats a suggéré un rôle du fragment FK506 dans la puissance cellulaire accrue de FK-GNE7915. Nous avons estimé que l'interaction FK506 – FKBP12 de haute affinité peut favoriser l'accumulation intracellulaire de FK-GNE7915 similaire au cas de RapaLink-1 et l'avons confirmé à l'aide d'une sonde fluorescente bifonctionnelle : FK-TAMRA (Extended Data Fig. 7). Cette fonctionnalité nous a permis de programmer l'inhibition de LRRK2 en contrôlant la disponibilité de FKBP12 ; alors que le traitement avec 100 nM de FK-GNE7915 réduisait le niveau de phospho-LRRK2 (S935) à 15 % du niveau de base, la combinaison de 100 nM de FK-GNE7915 et de 1 µM de RapaBlock n'avait aucun effet sur l'activité de LRRK2 (Fig. 5e).

a, Structures de GNE7915 et FK-GNE7915. b, modèle de travail proposé pour les inhibiteurs de kinase dépendant de FKBP. c, inhibition de la kinase en l'absence ou en présence de protéine FKBP12 recombinante 10 uM complétée (n = 2 ; les données sont présentées sous forme de points individuels). d, e, les cellules RAW264.7 ont été traitées avec GNE7915, FK-GNE7915 et/ou RapaBlock, et phospho-LRRK2 (S935) a été analysé par FRET à résolution temporelle en utilisant des anticorps épitopiques orthogonaux pour LRRK2 et p-LRRK2 (S935) (n = 3 ; les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd). Voir les informations supplémentaires pour les détails expérimentaux.

Données source

La conversion réussie de GNE7915 en un inhibiteur de LRRK2 dépendant de FKBP en le liant simplement à un fragment de FK506 nous a incités à évaluer la généralité de cette stratégie. Nous avons exploré plusieurs inhibiteurs de kinase qui sont à l'étude pour les maladies du SNC : le dasatinib (inhibiteur de kinase de la famille Src pour le glioblastome)42,43, le lapatinib (inhibiteur d'EGFR/HER2 pour le glioblastome)44,45 et la prostétine (inhibiteur de MAP4K4 pour la sclérose latérale amyotrophique et la maladie d'Alzheimer)46. Dans les trois cas, la liaison chimique de l'inhibiteur de kinase à FK506 a donné des molécules bifonctionnelles qui ont conservé les activités inhibitrices de kinase des molécules mères (Extended Data Figs. 8–10). Pour le FK-dasatinib, nous avons également examiné sa spécificité de cible en utilisant à la fois le profilage biochimique (Invitrogen SelectScreen Kinase Profiling; Tableau supplémentaire 1) et le profilage de la kinase des cellules vivantes47. Parmi les cibles rapportées du dasatinib, les kinases de la famille Src étaient puissamment inhibées par le dasatinib et le FK-dasatinib, tandis que quelques tyrosine kinases (par exemple, DDR2) présentaient une sensibilité différentielle à ces deux inhibiteurs (Extended Data Fig. 8c). Malgré leurs poids moléculaires élevés, ces molécules bifonctionnelles étaient actives dans les cellules avec des puissances comparables à leurs composés parents et sensibles à la désactivation par RapaBlock. Bien que ces exemples représentent un ensemble limité d'inhibiteurs de kinase avec des indications potentielles de maladie du SNC, il est concevable que davantage de médicaments puissent être configurés de manière similaire avec une pharmacologie programmable sans perdre de puissance cellulaire.

En exploitant la dépendance fonctionnelle unique des analogues de la rapamycine vis-à-vis de FKBP12, nous avons développé une approche pour obtenir une inhibition mTOR spécifique au cerveau grâce à l'administration simultanée d'un puissant inhibiteur de mTOR (RapaLink-1) et d'un ligand perméable aux cellules et imperméable à la BBB de FKBP12 (RapaBlock). L'inhibition de mTOR restreinte aux tissus activée par cette stratégie de pharmacologie binaire a réduit la toxicité dans les tissus périphériques, mais a maintenu les avantages thérapeutiques de RapaLink-1 dans les modèles de xénogreffe de glioblastome. Sur la base de ces résultats, il semble raisonnable d'anticiper que la même combinaison de médicaments pourrait avoir une valeur plus large dans d'autres maladies du SNC entraînées par une activité mTOR dérégulée, comme le trouble lié à la consommation d'alcool35.

L'applicabilité de notre approche s'étend au-delà de l'inhibition de mTOR. Nous montrons que la liaison chimique des inhibiteurs de kinase du site ATP à FK506 par des groupes exposés au solvant conduit à une nouvelle classe d'inhibiteurs de kinase perméables aux cellules dont l'activité dépend de la protéine endogène abondante FKBP12. Ces inhibiteurs sont caractérisés par leur capacité à médier la formation d'un complexe ternaire du médicament, la kinase cible et FKBP12, ainsi que leur capacité à moduler l'activité par RapaBlock. D'autres études in vivo et la chimie médicinale sont nécessaires pour évaluer et optimiser ces composés au cas par cas, mais nos premières investigations montrent qu'il est possible d'obtenir une inhibition sélective de la kinase cérébrale de LRRK2 en utilisant un inhibiteur de kinase dépendant de FKBP (FK-GNE7915) et RapaBlock.

Nous avons étudié le mécanisme par lequel RapaBlock contrôle l'activité cellulaire de RapaLink-1 ainsi que d'autres inhibiteurs de la kinase dépendante de FKBP12. Nos données actuelles ont révélé au moins deux rôles de FKBP12 cellulaire dans la fonction de RapaLink-1 (et d'autres composés liant FKBP12). Tout d'abord, nous avons montré que FKBP12 sert de réservoir pour retenir et accumuler RapaLink-1 à l'intérieur de la cellule, atteignant une concentration cellulaire exceptionnelle. Deuxièmement, pour la plupart des inhibiteurs de kinase dépendants de FKBP12 que nous avons étudiés, FKBP12 améliore leur puissance dans les essais sans cellule. Bien que nous n'ayons pas obtenu de preuves directes, nous émettons l'hypothèse que dans les solutions aqueuses, un composé bifonctionnel construit avec des lieurs flexibles entre des pharmacophores hydrophobes adoptera principalement une conformation incompétente pour minimiser la pénalité d'hydratation ("effondrement hydrophobe"), et la liaison de FKBP12 exposera le fragment inhibiteur pour permettre l'inhibition de la cible. RapaBlock entrave ces deux processus en occupant le site de liaison au ligand de FKBP12. Bien qu'une enquête plus approfondie soit clairement nécessaire pour élucider comment ces composés de haut poids moléculaire pénètrent dans les cellules et si FKBP12 participe à l'interaction de liaison avec la protéine cible, nous pensons que ce système fournit une approche généralisable pour l'inhibition de la kinase programmable.

La combinaison de deux agents pharmaceutiques pour obtenir des effets thérapeutiques sélectifs sur les tissus a déjà été utilisée dans des médicaments approuvés pour une utilisation clinique ou en développement. Les exemples incluent la lévodopa-carbidopa (précurseur de la dopamine perméable à la BBB-inhibiteur de la DOPA décarboxylase imperméable à la BBB) pour la maladie de Parkinson48, les œstrogènes conjugués-bazédoxifène (œstrogènes perméables à la BBB-modulateur des récepteurs aux œstrogènes imperméable à la BBB) pour les bouffées de chaleur post-ménopausiques et l'ostéoporose49, et le donépézil-solifénacine (acétate perméable à la BBB). inhibiteur de l'ylcholinestérase – anticholinergique imperméable à la BBB) pour la maladie d'Alzheimer50. Notre approche diffère de ces précédents en ce qu'elle n'implique pas deux médicaments ayant des effets antagonistes sur la même cible ou voie ; au lieu de cela, RapaBlock contrôle la spécificité tissulaire en atténuant directement l'activité de l'inhibiteur de kinase. Le présent système a donc l'avantage d'être adaptable à une multitude de cibles, ne nécessitant qu'une molécule RapaBlock invariante et un inhibiteur dépendant de FKBP12 qui peut être facilement conçu sur la base des structures de FK506 et des composés principaux. Bien que nous nous soyons concentrés sur les protéines kinases dans cette étude, il semble raisonnable de s'attendre à ce que l'approche soit également applicable à d'autres classes de cibles thérapeutiques, telles que les GTPases et les enzymes de modification des histones.

Les séquences d'ADN codant pour la FKBP12 humaine pleine longueur ont été synthétisées par Twist Biosciences et clonées dans le vecteur pET47b en utilisant des techniques de biologie moléculaire standard. L'expression des protéines a été réalisée dans la souche Escherichia coli BL21(DE3). En bref, des cellules BL21 (DE3) chimiquement compétentes ont été transformées avec pET47b-FKBP12 et cultivées sur des plaques de milieu LB contenant 50 µg ml – 1 kanamycine à 37 ° C. Une seule colonie a été utilisée pour inoculer une culture à 37 °C à 220 tr/min dans un excellent bouillon contenant 50 µg ml–1 kanamycine. Lorsque la densité optique a atteint 0,6, l'expression de la protéine a été induite par l'ajout d'IPTG à 1 mM. Après 2 h à 37 ° C, les cellules ont été culottées par centrifugation (6 500 g pendant 10 min) et lysées dans un tampon de lyse (20 mM Tris 8.0, 500 mM NaCl et 5 mM imidazole) avec un homogénéisateur haute pression (Microfluidics). Le lysat a été clarifié par centrifugation à grande vitesse (19 000 g pendant 15 min) et le surnageant a été utilisé dans une purification ultérieure par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé. Le FKBP12 marqué par His a été capturé par incubation avec de la résine Co-TALON (Clonetech, Takara Bio USA, 4 ml de suspension par litre de culture) à 4 ° C pendant 1 h avec un mélange constant de bout en bout. Les billes chargées ont ensuite été lavées avec un tampon de lyse (50 ml de culture l–1) et la protéine a été éluée avec un tampon d'élution (20 mM Tris 8.0, 500 mM NaCl et 300 mM imidazole). L'étiquette His a été clivée avec la protéase HRV 3C marquée His (Clonetech, Takara Bio USA, culture de 5 U l–1) à 4 ° C jusqu'à ce que l'analyse par chromatographie liquide et spectrométrie de masse du mélange réactionnel indique plus de 95% de clivage. Le mélange réactionnel a été concentré à l'aide d'un concentrateur centrifuge 10K MWCO (Amicon-15, Millipore) à 20 mg ml-1 et purifié par chromatographie d'exclusion de taille sur une colonne Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare Life Sciences) avec un tampon SEC (20 mM HEPES pH 7,5 et 150 mM NaCl). Les fractions contenant la protéine FKBP12 pure ont été regroupées et concentrées à 20 mg ml–1 et stockées à –78 °C. Ce protocole donne un rendement typique de 10 à 20 mg l–1 de culture pour FKBP12.

L'affinité de liaison du composé a été déterminée en utilisant un test de polarisation de fluorescence de compétition. Une molécule traceur fluorescente à base de rapamycine (FITC-Rapa)33 a été synthétisée en interne. Le tampon de dosage était HEPES 20 mM pH 7,5 et 0,01 % de Triton X-100. La constante de dissociation (Kd) de la molécule traceur pour FKBP12 a d'abord été déterminée en mesurant la polarisation de fluorescence (excitation de 485 nm et émission de 535 nm) à diverses concentrations de protéines et en ajustant la courbe à un modèle de liaison quadratique. Pour mesurer l'affinité de liaison du composé, des mélanges avec la composition suivante ont été préparés en double dans des plaques opaques noires à 96 puits (Corning 3915) : 0,5 nM FITC-Rapa, 1 nM FKBP12, 5 % DMSO et 5 µM à 0,08 nM de composé test, volume total 200 µl. La polarisation de fluorescence a été mesurée sur un lecteur de plaques TECAN Spark 20M (excitation de 485 nm et émission de 535 nm). Les données ont été ajustées à une courbe sigmoïde à trois paramètres pour dériver les valeurs IC50. Le Ki des composés a été calculé à l'aide d'un outil fourni par le laboratoire de S. Wang (http://www.umich.edu/~shaomengwanglab/software/calc_ki/index.html). Les données ont été tracées dans GraphPad Prism 9.0.

Les cellules MCF7 ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC; HTB-22) et maintenues dans 1: 1 DMEM: F12 (Gibco) plus 10% de FBS inactivé par la chaleur (Axenia Biologix) additionné de 4 mM de l-glutamine, 100 U ml-1 pénicilline et 100 U ml-1 streptomycine (Gibco). Les cellules SK-BR-3 ont été obtenues auprès de l'ATCC (HTB-30) et maintenues dans McCoy's 5A (Gibco) plus 10% de FBS inactivé par la chaleur additionné de 2 mM de l-glutamine, 100 U ml-1 pénicilline et 100 U ml-1 streptomycine (Gibco). Les cellules K562 CRISPRi étaient un cadeau de L. Gilbert et maintenues dans du RPMI 1640 (Gibco) plus 10% de FBS inactivé par la chaleur additionné de 2 mM de l-glutamine, 100 U ml – 1 pénicilline, 100 U ml – 1 streptomycine (Gibco) et 0, 1% de Pluronic F-68 (Gibco). Les cellules RAW264.7 ont été obtenues auprès de l'ATCC (TIB-71) et maintenues dans du DMEM (Gibco) plus 10 % de FBS inactivé par la chaleur additionné de 2 mM de l-glutamine, 100 U ml-1 de pénicilline et 100 U ml-1 de streptomycine (Gibco). Des cellules Jurkat ont été obtenues auprès de l'ATCC (TIB-152) et maintenues dans du RPMI 1640 (Gibco) plus 10% de FBS inactivé par la chaleur additionné de 2 mM de l-glutamine, 100 U ml-1 de pénicilline et 100 U ml-1 de streptomycine (Gibco). Les cellules Jurkat-Lucia NFAT ont été obtenues auprès d'InvivoGen et maintenues dans IMDM (Gibco) plus 10% de FBS inactivé par la chaleur additionné de 2 mM de l-glutamine, 100 U ml-1 pénicilline, 100 U ml-1 streptomycine (Gibco) et 100 µg ml-1 Zéocine (InvivoGen). Les cellules HEK293T ont été obtenues auprès de l'UCSF Cell Culture Facility et maintenues dans 1: 1 DMEM: F12 (Gibco) plus 10% de FBS inactivé par la chaleur additionné de 4 mM de l-glutamine, 100 U ml – 1 pénicilline et 100 U ml – 1 streptomycine (Gibco). Toutes les lignées cellulaires ont été testées mycoplasmes négatives à l'aide du kit de détection de mycoplasmes MycoAlert (Lonza). Les lignées cellulaires de l'ATCC étaient des répétitions aléatoires courtes (STR) profilées par le fabricant. Les cellules Jurkat-Lucia NFAT sont une lignée cellulaire commerciale développée par InvivoGen et authentifiée par le fabricant. Les lignées cellulaires de l'installation de culture cellulaire de l'UCSF ont été profilées STR par l'installation de culture cellulaire de l'UCSF. Aucune autre authentification n'a été effectuée après l'achat. Lorsque cela était indiqué, les cellules ont été traitées avec des médicaments à une confluence de 60 à 80 % à une concentration finale de DMSO de 1 %. A la fin de la période de traitement, les cellules ont été placées sur de la glace et lavées une fois avec du PBS. Sauf indication contraire, les cellules ont été grattées à la spatule, culottées par centrifugation (500g pendant 5 min) et lysées dans du tampon RIPA (25 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS 1% NP-40 et 0,5% désoxycholate de sodium) additionné d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase (cOmplete et phosSTOP, Roche) sur glace pendant 10 min. Les lysats ont été clarifiés par centrifugation à grande vitesse (19 000 g pendant 10 min). Les concentrations de lysats ont été déterminées avec un test de protéine BCA (Thermo Fisher) et ajustées à 2 mg ml–1 avec un tampon RIPA supplémentaire. Les échantillons ont été mélangés avec un colorant de chargement SDS 5 × et chauffés à 95 ° C pendant 5 min.

Sauf indication contraire, SDS – PAGE a été exécuté avec du gel Novex 4–12% Bis-Tris (Invitrogen) dans un tampon de fonctionnement MES (Invitrogen) à 200 V pendant 40 min en suivant les instructions du fabricant. Les bandes de protéines ont été transférées sur des membranes de nitrocellulose de 0, 45 µm (Bio-Rad) à l'aide d'un appareil de transfert à réservoir humide (Bio-Rad Criterion Blotter) dans un tampon TOWBIN 1 × avec 10% de méthanol à 75 V pendant 45 min. Les membranes ont été bloquées dans 5 % de BSA-TBST pendant 1 h à 23 °C. La liaison primaire des anticorps a été réalisée avec les anticorps indiqués dilués dans 5% de BSA-TBST à 4 ° C pendant au moins 16 h. Après avoir lavé la membrane trois fois avec du TBST (5 min pour chaque lavage), des anticorps secondaires (chèvre anti-lapin IgG-IRDye 800 et chèvre anti-souris IgG-IRDye 680 ; Li-COR) ont été ajoutés sous forme de solutions dans du lait écrémé à 5 % - TBST aux dilutions recommandées par le fabricant. La liaison de l'anticorps secondaire a été autorisée à se dérouler pendant 1 h à 23 ° C. La membrane a été lavée trois fois avec du TBST (5 min pour chaque lavage) et imagée sur un imageur de fluorescence Li-COR Odyssey. Voir le tableau supplémentaire 2 pour une liste complète des anticorps utilisés dans cette étude.

Les cellules Jurkat-Lucia NFAT ont été remises en suspension à 2 × 106 cellules par ml dans du milieu de croissance frais et distribuées dans des plaques de culture tissulaire à 96 puits (Corning 3904; 180 µl par puits). Des solutions DMSO de composés d'essai à 100 fois les concentrations d'essai ont été ajoutées et les cellules ont été incubées pendant 4 h à 37 °C. Une solution de stimulation 10× contenant de l'acétate de myristate de phorbol (100 ng ml–1) et de l'ionomycine (10 µg ml–1) a été ajoutée à chaque puits (20 µl par puits) à l'exception des puits de contrôle négatif, qui ont été complétés avec 20 µl de milieu. Les cellules ont été incubées à 37°C pendant 12h. Les cellules (20 ul par puits) ont été transférées dans une plaque blanche opaque à 96 puits (Corning 3912). Le lecteur de plaques TECAN Spark 20M équipé d'un système d'auto-injection a été amorcé avec une solution de substrat de luciférase Lucia et réglé avec les paramètres suivants : 50 µl de volume d'injection, mesure du point final avec un temps de retard de 4 s et un temps d'intégration de 0,1 s. L'activité de la luciférase a été mesurée avec les paramètres ci-dessus et normalisée par rapport aux cellules stimulées traitées au DMSO. Les données ont été tracées dans GraphPad Prism 9.0.

Les cellules Jurkat ont été cultivées et traitées comme décrit dans la section « Culture cellulaire ». A la fin de la période de traitement, une aliquote de 1,5 ml de cellules a été culottée (500 g pendant 5 min) et lavée une fois avec du RPMI sans sérum (1 ml). Le surnageant a été retiré et les cellules ont été remises en suspension dans 100 µl 5 µg ml–1 OKT3 (Invitrogen ; qualité fonctionnelle) dans du RPMI et immédiatement placées dans un bain-marie à 37 °C. A 5 min, 25 µl de tampon de chargement 5X SDS ont été ajoutés et mélangés rapidement avec les cellules. L'échantillon a été soniqué à une puissance de sortie de 30 % pendant 60 s (1 s allumé, 1 s éteint) à l'aide du sonicateur Qsonica Q500 pour cisailler l'ADN. Les échantillons ont été chauffés à 95 ° C pendant 5 min et utilisés pour SDS-PAGE.

Phospho-LRRK2 (S935) a été quantifié dans des cellules traitées avec un médicament à l'aide d'un kit cellulaire Phospho-LRRK2 (Ser935) (Cisbio) en suivant les instructions du fabricant. Des cellules RAW264.7 (2 × 105 cellules par ml) ont été étalées dans des plaques de culture tissulaire à six puits (2 ml par puits) 24 h avant le traitement. Les cellules ont été traitées avec des composés aux concentrations indiquées pendant 2 h. Le milieu a été éliminé par aspiration et les cellules ont été rincées avec du PBS glacé (1 ml). Les cellules ont été lysées avec 100 µl de tampon de lyse Cisbio 1X à 23 °C directement dans la plaque pendant 30 min. Les lysats ont été transférés dans des microtubes et clarifiés par centrifugation (19 000 g pendant 10 min). Le lysat clarifié (16 µl) a été distribué dans un puits d'une plaque à 384 puits à fond rond et à faible volume, et 4 µl de mélange maître d'anticorps LRRK2 – phospho-LRRK2 (S935) (Cisbio) ont été ajoutés à chaque puits. La plaque a été incubée à 23°C pendant 4h. La fluorescence résolue en temps a été lue sur un lecteur de plaque TECAN Spark 20M avec les paramètres suivants : temps de latence de 60 µs ; temps d'intégration de 500 µs ; lecture A inclus filtre d'excitation de 320 (25) nm, filtre d'émission de 610 (25) nm et gain de 130 ; la lecture B comprenait un filtre d'excitation de 320 (25) nm, un filtre d'émission de 665 (8) nm et un gain de 165.

Le signal TR-FRET a été calculé comme le rapport intensité de fluorescence [lire B]/[lire A]. Les données ont été tracées dans GraphPad Prism 9.0.

Les cellules HEK293T ont été transfectées avec des vecteurs d'emballage standard en utilisant le réactif de transfection TransIT-LT1 (Mirus Bio). Le surnageant viral a été recueilli 2 à 3 jours après la transfection, filtré à travers des filtres de difluorure de polyvinylidène de 0, 45 μm (Millipore Sigma) et congelé à -80 ° C avant la transduction.

Les protospaceurs sgRNA ciblant GAL4-4 (témoin négatif sg GAACGACTAGTTAGGCTGTA) et FKBP12 (FKBP12 sg1 GACGGCTCTGCCTAGTACCT et FKBP12 sg2 GCCCAGGAGACGGTGAGTAG)51 ont été clonés dans pCRISPRia-v2 (marqué avec une cassette de résistance à la puromycine et BFP ; Addgene #84832). En bref, des oligonucléotides synthétiques complémentaires (Integrated DNA Technologies) avec des sites de restriction BstXI et BlpI flanquants ont été recuits et ligaturés avec pCRISPRia-v2 digéré par BstXI et BlpI. Les vecteurs d'expression de sgRNA ont été emballés dans des lentivirus comme décrit ci-dessus. Des cellules knockdown ont été générées en transduisant des cellules K562 CRISPRi (sgRNA–) avec les vecteurs d'expression sgRNA à une multiplicité d'infection inférieure à 1 (taux de transduction de 20 à 40 %) avec 8 μg ml–1 de polybrène. À partir du deuxième jour suivant l'ajout de lentivirus, les cellules transduites (ARNsg +) ont été sélectionnées à l'aide de 2 μg ml – 1 puromycine (Gibco) jusqu'à ce que chaque population cellulaire atteigne de manière stable 95% ou plus de BFP + (laser d'excitation à 405 nm et filtre d'émission 440/50 nm) par cytométrie en flux sur un Attune NxT (Thermo Fisher Scientific).

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques blanches à fond plat à 96 puits (1 000 cellules par puits) (Corning) et incubées pendant une nuit. Les cellules ont été traitées avec les composés indiqués dans une série de dilutions triples en neuf points (volume final de 100 μl) et incubées pendant 72 h. Dans certaines conditions, 10 μM de FK506 ont été uniformément ajoutés à la série de dilutions. La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide d'un test commercial basé sur la luminescence CellTiter-Glo (CTG) (Promega). En bref, les plaques à 96 puits ont été équilibrées à température ambiante avant l'ajout de réactif CTG dilué (100 μl) (réactif CTG 1: 4: PBS). Les plaques ont été placées sur un agitateur orbital pendant 30 min avant d'enregistrer la luminescence à l'aide d'un lecteur de plaques Spark 20M (TECAN). Les données ont été tracées dans GraphPad Prism 9.0.

Des cellules K562 CRISPRi non transduites (pas de virus ou de sgRNA-) et transduites par le vecteur d'expression de sgRNA (sgRNA +) ont été mélangées dans un rapport de 1: 1, étalées dans des plaques à 48 puits et incubées pendant la nuit. Les mélanges de cellules ont été traités avec les composés liés à TAMRA indiqués (volume final de 300 µl) et incubés pendant 24 h. Les plaques ont été placées sur de la glace et 200 μl de chaque mélange composé-cellule ont été transférés dans une plaque à fond en U à 96 puits. Les cellules ont été culottées à 500 g pendant 5 min, puis lavées 2 fois avec un tampon FACS glacé (PBS + 1 % BSA + 0,1 % NaN3). Les cellules ont été remises en suspension dans 200 ul de tampon FACS glacé et évaluées à l'aide d'un Attune NxT (Thermo Fisher Scientific). L'absorption relative des composés liés à TAMRA a été déterminée en comparant la fluorescence TAMRA (laser d'excitation à 561 nm et filtre d'émission à 585/16 nm) entre les cellules sgRNA– et sgRNA+ dans chaque puits.

Les tests d'inhibition de la kinase in vitro ont été effectués par SelectScreen Services (Thermo Fisher Scientific) en utilisant le format de test Z'-LYTE (mTOR, Src, Csk, EGFR, HER2 et HGK), Adapta (LRRK2) ou LanthaScreen (DDR2) (les protocoles standardisés sont accessibles sur le site Web de SelectScreen : https://www.thermofisher.com/us/en/home/products-and-services/services/custom-service s/screening-and-profiling-services/selectscreen-profiling-service/selectscreen-kinase-profiling-service.html Lorsque cela est indiqué, la protéine FKBP12 recombinante a été ajoutée au mélange de test à une concentration finale de 10 µM.

Toutes les expérimentations animales ont été menées à l'aide de protocoles approuvés par l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l'Université de Californie à San Francisco. Des souris nude athymiques femelles BALB/Cnu/nu athymiques (âgées de 4 à 6 semaines) ont été utilisées pour des expériences in vivo. Toutes les souris du Helen Diller Cancer Center UCSF ont été logées dans des cages de microisolateur ventilées individuellement. Les racks de logement avaient de l'eau automatique qui était stérilisée par filtration, osmose inverse et exposition aux rayons UV. Toutes les souris ont reçu un régime alimentaire standard pré-irradié. Le cycle lumière-obscurité était de 12 h de lumière et de 12 h d'obscurité. La température a été maintenue dans la plage de 68 à 74 ° F. L'humidité a été maintenue entre 30 et 70 %. L'analyse Western blot de la signalisation mTOR a utilisé des souris femelles BALB/Cnu/nu athymiques âgées de 4 à 6 semaines (trois par groupe ; randomisées) qui ont été traitées avec des injections intrapéritonéales de véhicule (20 % DMSO, 40 % PEG-300 et 40 % PBS (v/v)), RapaLink-1 (1 mg par kg), RapaBlock (40 mg par kg) et une combinaison de RapaLink-1 (1 mg par kg) et RapaB lock (40 mg par kg) pendant 15 min, suivi d'une injection intrapéritonéale de 250 mU d'insuline ou de solution saline, puis euthanasié 15 min plus tard. Le muscle squelettique et le cerveau de chaque souris ont été lysés et analysés par western blot. Pour les injections orthotopiques et les études de traitement, des souris femelles BALB/Cnu/nu (âgées de 4 à 6 semaines) ont été anesthésiées à l'aide d'isoflurane. Des cellules U87MG (3 × 105) exprimant la luciférase de luciole ont été injectées par voie intracrânienne (seringue Hamilton) aux coordonnées 2 mm antérieures et 1, 5 mm latérales de l'hémisphère droit par rapport à Bregma, à une profondeur de 3 mm. La bioluminescence du cerveau entier a été mesurée pour chaque souris tous les 5 jours. Lorsque la bioluminescence a atteint 106 photons par seconde, les souris ont été randomisées en quatre groupes de signal bioluminescent moyen égal (sept souris par groupe) et la thérapie a été initiée. Les groupes ont été traités par injection intrapéritonéale de véhicule (20 % DMSO, 40 % PEG-300 et 40 % PBS (v/v)), RapaLink-1 (1,0 mg par kg), RapaBlock (40 mg par kg) ou une combinaison de RapaLink-1 (1,0 mg par kg) et RapaBlock (40 mg par kg) tous les 5 jours pendant 25 à 30 jours. Les souris ont été surveillées quotidiennement et euthanasiées lorsqu'elles présentaient des déficits neurologiques ou une réduction de 15 % par rapport au poids corporel initial. Pour les études de xénogreffe GBM43, des cellules GBM43 (1 × 105) exprimant la luciférase de luciole ont été injectées par voie intracrânienne (seringue Hamilton) aux coordonnées 2 mm antérieures et 1, 5 mm latérales de l'hémisphère droit par rapport à Bregma, à une profondeur de 3 mm. La bioluminescence du cerveau entier a été mesurée pour chaque souris tous les 5 jours. Lorsque la bioluminescence a atteint 106 photons par seconde, les souris ont été randomisées en quatre groupes de signal bioluminescent moyen égal (cinq souris par groupe) et la thérapie a été initiée. Les groupes ont été traités par injection intrapéritonéale de véhicule (20 % DMSO, 40 % PEG-300 et 40 % PBS (v/v)), RapaLink-1 (1,2 mg par kg), RapaBlock (60 mg par kg) ou une combinaison de RapaLink-1 (1,2 mg par kg) et RapaBlock (60 mg par kg) tous les 5 jours pendant 15 à 20 jours. Les souris ont été surveillées quotidiennement et euthanasiées lorsqu'elles présentaient des déficits neurologiques ou une réduction de 15 % par rapport au poids corporel initial. Les chercheurs ont été aveuglés par l'affectation de groupes de souris pour l'imagerie de l'activité de la luciférase et la mesure de la charge tumorale.

Voir les notes supplémentaires 2 et 3 pour plus de détails sur la synthèse chimique et les spectres RMN 1H et 13C de RapaBlock.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les images de gel non traitées pour tous les immunoblots (Figs. 1d, 3a, d et 4a et données étendues Figs. 3, 4c, 5, 8e, f et 9d) sont fournies dans la Fig. 1 supplémentaire. Toutes les données qui appuient les conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Les données sources sont fournies avec ce document.

Johnson, TE et al. Les statines induisent l'apoptose chez le rat et les cultures de myotubes humains en inhibant la géranylgéranylation des protéines mais pas l'ubiquinone. Toxicol. Appl. Pharmacol. 200, 237-250 (2004).

CAS PubMed Google Scholar

Reiner, PB & Kamondi, A. Mécanismes de la sédation induite par les antihistaminiques dans le cerveau humain : l'activation des récepteurs H1 réduit un courant de fuite de potassium de fond. Neuroscience 59, 579–588 (1994).

CAS PubMed Google Scholar

Li, M. et al. Efficacité et sécurité des inhibiteurs de mTOR (rapamycine et ses analogues) pour le complexe de la sclérose tubéreuse : une méta-analyse. Orphanet J. Rare Dis. 14, 1–9 (2019).

Google Scholar

Franz, DN et al. La rapamycine provoque la régression des astrocytomes dans le complexe de la sclérose tubéreuse. Anne. Neurol. 59, 490–498 (2006).

CAS PubMed Google Scholar

Rageot, D. et al. Découverte et caractérisation préclinique de la 5-[4,6-bis({3-oxa-8-azabicyclo[3.2.1]octan-8-yl})-1,3,5-triazine-2-yl]-4-(difluorométhyl)pyridin-2-amine (PQR620), un inhibiteur mTORC1/2 très puissant et sélectif pour le cancer et les troubles neurologiques. J. Med. Chim. 61, 10084-10105 (2018).

CAS PubMed Google Scholar

Akhavan, D., Cloughesy, TF & Mischel, PS Appris du banc au chevet. Neuro Oncol. 12, 882–889 (2010).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fan, QW et al. Un inhibiteur de kinase ciblé sur mTORC1 entraîne une régression dans le glioblastome. Cellule cancéreuse 31, 424–435 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lapointe, S. et al. Une étude de phase I du vistusertib (double inhibiteur de mTORC1/2) chez des patients atteints de glioblastome multiforme préalablement traité : une étude CCTG. Investir. Nouveaux médicaments 38, 1137-1144 (2020).

CAS PubMed Google Scholar

Bibliothèque nationale de médecine des États-Unis. ClinicalTrials.gov https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04774952 (2022).

Neasta, J. et al. Rôle de la cible mammifère de la signalisation du complexe de rapamycine 1 dans les neuroadaptations sous-jacentes aux troubles liés à l'alcool. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 107, 20093–20098 (2010).

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barak, S. et al. La perturbation des souvenirs liés à l'alcool par l'inhibition de mTORC1 prévient les rechutes. Nat. Neurosci. 16, 1111-1117 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morisot, N., Novotny, CJ, Shokat, KM et Ron, D. Une nouvelle génération d'inhibiteurs de mTORC1 atténue la consommation d'alcool et la récompense chez la souris. Toxicomane. Biol. 23, 713–722 (2018).

CAS PubMed Google Scholar

Pallet, N. & Legendre, C. Événements indésirables associés aux inhibiteurs de mTOR. Avis d'expert. Médicament sûr. 12, 177-186 (2013).

CAS PubMed Google Scholar

González, D. et al. Croissance des patients pédiatriques transplantés rénaux traités par sirolimus. Pédiatre Néphrol. 26, 961–966 (2011).

Google Scholar PubMed

Chiu, MI, Katz, H. & Berlin, V. RAPT1, un homologue mammifère de la levure Tor, interagit avec le complexe FKBP12/rapamycine. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 91, 12574-12578 (1994).

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Loewith, R. et al. Deux complexes TOR, dont un seul est sensible à la rapamycine, ont des rôles distincts dans le contrôle de la croissance cellulaire. Mol. Cellule 10, 457–468 (2002).

CAS PubMed Google Scholar

Gaubitz, C. et al. Base moléculaire de l'insensibilité à la rapamycine de la cible du complexe de rapamycine 2. Mol. Cellule 58, 977–988 (2015).

CAS PubMed Google Scholar

Feldman, ME et al. Les inhibiteurs du site actif de mTOR ciblent les sorties résistantes à la rapamycine de mTORC1 et mTORC2. PLoS Biol. 7, 0371-0383 (2009).

Google Scholar

García-Martinez, JM et al. Ku-0063794 est un inhibiteur spécifique de la cible mammifère de la rapamycine (mTOR). Biochimie. J. 421, 29-42 (2009).

Google Scholar PubMed

Thoreen, CC et al. Une cible mammalienne compétitive pour l'ATP de l'inhibiteur de la rapamycine révèle les fonctions résistantes à la rapamycine de mTORC1. J. Biol. Chim. 284, 8023–8032 (2009).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rodrik-Outmezguine, VS et al. Surmonter les mutations de résistance mTOR avec un inhibiteur mTOR de nouvelle génération. Nature 534, 272-276 (2016).

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marinec, PS et al. La protéine de liaison FK506 (FKBP) répartit un inhibiteur modifié de la protéase du VIH dans les cellules sanguines et prolonge sa durée de vie in vivo. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 106, 1336-1341 (2009).

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Orange, DE et al. Les cellules dendritiques chargées de FK506 tuent les lymphocytes T d'une manière spécifique à l'antigène et préviennent l'auto-immunité in vivo. eLife 2, e00105 (2013).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, J. et al. La calcineurine est une cible commune des complexes cyclophiline-cyclosporine A et FKBP-FK506. Cellule 66, 807–815 (1991).

CAS PubMed Google Scholar

Griffith, JP et al. Structure aux rayons X de la calcineurine inhibée par le complexe immunophiline-immunosuppresseur FKBP12-FK506. Cellule 82, 507–522 (1995).

CAS PubMed Google Scholar

Brown, EJ et al. Protéine de mammifère ciblée par le complexe récepteur de la rapamycine bloquant G1. Nature 369, 756–758 (1994).

ADS CAS PubMed Google Scholar

Sabatini, DM, Erdjument-Bromage, H., Lui, M., Tempst, P. & Snyder, SH RAFT1 : une protéine de mammifère qui se lie à FKBP12 de manière dépendante de la rapamycine et est homologue aux TOR de levure. Cellule 78, 35–43 (1994).

CAS PubMed Google Scholar

Holt, DA et al. Conception, synthèse et évaluation cinétique de ligands FKBP de haute affinité. Confiture. Chim. Soc. 115, 9925–9938 (1993).

CAS Google Scholar

Banaszynski, LA, Chen, LC, Maynard-Smith, LA, Ooi, AG & Wandless, TJ Une méthode rapide, réversible et accordable pour réguler la fonction des protéines dans les cellules vivantes à l'aide de petites molécules synthétiques. Cellule 126, 995-1004 (2006).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pajouhesh, H. & Lenz, GR Propriétés chimiques médicinales des médicaments efficaces du système nerveux central. NeuroRx 2, 541-553 (2005).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Rankovic, Z. Conception de médicaments CNS : équilibrer les propriétés physicochimiques pour une exposition optimale du cerveau. J. Med. Chim. 58, 2584-2608 (2015).

CAS PubMed Google Scholar

Clemons, PA et al. Synthèse de dérivés résistants à la calcineurine de FK506 et sélection de récepteurs compensatoires. Chim. Biol. 9, 49–61 (2002).

CAS PubMed Google Scholar

Kozany, C., März, A., Kress, C. & Hausch, F. Sondes fluorescentes pour caractériser les protéines de liaison au FK506. ChemBioChem 10, 1402–1410 (2009).

CAS PubMed Google Scholar

Dumont, FJ, Staruch, MJ, Koprak, SL, Melino, MR & Sigal, NH Mécanismes distincts de suppression de l'activation des lymphocytes T murins par les macrolides apparentés FK-506 et la rapamycine. J. Immunol. 144, 251–258 (1990).

CAS PubMed Google Scholar

Ehinger, Y. et al. L'inhibition spécifique au cerveau de mTORC1 élimine les effets secondaires résultant du blocage de mTORC1 à la périphérie et réduit la consommation d'alcool chez la souris. Nat. Commun. 12, 4407 (2021).

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sarkaria, JN et al. Utilisation d'un modèle de xénogreffe orthotopique pour évaluer l'effet de l'amplification du récepteur du facteur de croissance épidermique sur la réponse au rayonnement du glioblastome. Clin. Cancer Rés. 12, 2264-2271 (2006).

CAS PubMed Google Scholar

Estrada, AA et al. Découverte de petites molécules inhibitrices de la kinase répétée 2 (LRRK2) hautement puissantes, sélectives et pénétrant dans le cerveau de l'aminopyrazole riche en leucine. J. Med. Chim. 57, 921–936 (2014).

CAS PubMed Google Scholar

Lee, BD, Dawson, VL & Dawson, TM Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) comme cible thérapeutique potentielle dans la maladie de Parkinson. Tendances Pharmacol. Sci. 33, 365–373 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rudenko, IN, Chia, R. & Cookson, MR L'inhibition de l'activité kinase est-elle la seule stratégie thérapeutique pour la maladie de Parkinson associée à LRRK2 ? BMC Med. 10, 20 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fuji, RN et al. Effet de l'inhibition sélective de la kinase LRRK2 sur le poumon de primate non humain. Sci. Trad. Méd. 7, 273ra15 (2015).

Google Scholar PubMed

Baptista, MAS et al. Les inhibiteurs de LRRK2 induisent des changements réversibles dans les poumons des primates non humains sans déficits pulmonaires mesurables. Sci. Trad. Méd. 12, eaav0820 (2020).

CAS PubMed Google Scholar

Lombardo, LJ et al. Découverte du N-(2-chloro-6-méthylphényl)-2-(6-(4-(2-hydroxyéthyl)-pipérazin-1-yl)-2-méthylpyrimidin-4-ylamino)thiazole-5-carboxamide (BMS-354825), un double inhibiteur de kinase Src/Abl avec une puissante activité antitumorale dans les tests précliniques. J. Med. Chim. 47, 6658–6661 (2004).

CAS PubMed Google Scholar

Lassman, AB et al. Essai de phase 2 du dasatinib chez des patients sélectionnés avec un glioblastome récurrent (RTOG 0627). Neuro Oncol. 17, 992–998 (2015).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Medina, PJ & Goodin, S. Lapatinib : un double inhibiteur des tyrosine kinases du récepteur du facteur de croissance épidermique humain. Clin. Là. 30, 1426-1447 (2008).

CAS PubMed Google Scholar

Thiessen, B. et al. Un essai de phase I/II de GW572016 (lapatinib) dans le glioblastome multiforme récurrent : résultats cliniques, pharmacocinétique et corrélation moléculaire. Chimio du cancer. Pharmacol. 65, 353–361 (2010).

CAS PubMed Google Scholar

Bos, PH et al. Développement d'inhibiteurs de MAP4 kinase en tant qu'agents protecteurs des motoneurones. Chimie cellulaire. Biol. 26, 1703–1715.e37 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, Q. et al. Profilage de kinases à large spectre dans des cellules vivantes avec des sondes de fluorure de sulfonyle ciblées sur la lysine. Confiture. Chim. Soc. 139, 680–685 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bartholini, G., Burkard, WP, Pletscher, A. & Bates, HM Augmentation des catécholamines cérébrales causée par la 3,4-dihydroxyphénylalanine après inhibition de la décarboxylase périphérique. Nature 215, 852–853 (1967).

ADS CAS PubMed Google Scholar

Komm, BS & Mirkin, S. Evolution du complexe d'œstrogènes sélectifs tissulaires (TSEC). J.Cell. Physiol. 228, 1423-1427 (2013).

CAS PubMed Google Scholar

Chase, TN, Farlow, MR & Clarence-Smith, K. Donepezil plus solifénacine (CPC-201) traitement de la maladie d'Alzheimer. Neurotherapeutics 14, 405–416 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Horlbeck, MA et al. Bibliothèques de nouvelle génération compactes et hautement actives pour la répression et l'activation des gènes médiés par CRISPR. eLife 5, e19760 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Nous remercions J. Koach pour son aide dans le traitement des données ; D. Wassarman pour les discussions ; notre collègue UCSF M. Evans et son groupe pour de nombreuses discussions et études d'imagerie cérébrale de souris ; et L. Gilbert pour le don généreux de cellules K562 CRISPRi (dCas9-KRAB). ZZ est un boursier Damon Runyon soutenu par la Fondation Damon Runyon pour la recherche sur le cancer (DRG-2281-17). KL reconnaît NIH F30CA239476. KMS, QF et WAW reconnaissent NIH 1R01CA221969. KMS et WAW reconnaissent la Samuel Waxman Cancer Research Foundation. WAW reconnaît NIH U01CA217864 et Cancer Research UK A28592. KMS reconnaît la Michael J. Fox Foundation P0536220, la Mark Foundation for Cancer Research et le Howard Hughes Medical Institute.

Département de pharmacologie cellulaire et moléculaire, Howard Hughes Medical Institute, Université de Californie, San Francisco, Californie, États-Unis

Ziyang Zhang, Kevin Lou et Kevan M. Shokat

Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, San Francisco, Californie, États-Unis

Qiwen Fan, Xujun Luo et William A. Weiss

Département de neurologie, Université de Californie, San Francisco, Californie, États-Unis

Qiwen Fan, Xujun Luo et William A. Weiss

Département de pédiatrie, Université de Californie, San Francisco, Californie, États-Unis

William A. Weiss

Département de chirurgie neurologique, Université de Californie, San Francisco, Californie, États-Unis

William A. Weiss

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ZZ, QF, WAW et KMS ont conçu le projet, conçu et analysé les expériences et rédigé le manuscrit. WAW a supervisé les expériences in vivo. ZZ a effectué la synthèse chimique, les essais biochimiques et les expériences de culture cellulaire, et a analysé les données. KL a effectué les expériences de cytométrie en flux et les tests d'inhibition de la croissance dans les lignées cellulaires K562 CRISPRi et a analysé les données. QF et XL ont effectué les expériences in vivo et l'analyse par immunotransfert des échantillons de tissus, et ont analysé les données.

Correspondance à Kevan M. Shokat.

ZZ, QF, WAW et KMS sont co-inventeurs des demandes de brevet couvrant RapaBlock appartenant à l'UCSF. KMS est un inventeur des brevets couvrant RapaLink-1 appartenant à l'UCSF et sous licence à Revolution Medicines. KMS reçoit une rémunération monétaire et en actions et est membre du SAB de Genentech/Roche, Denali Therapeutics et Revolution Medicines. Les parents de KL détiennent des actions et sont employés par Pharmaron.

Nature remercie Nathanael Gray, Ingo Mellinghoff et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Illustration du test basé sur la cytométrie en flux pour évaluer l'accumulation cellulaire de composés TAMRA. b, Structure d'une sonde fluorescente RapaTAMRA. c, l'inactivation de FKBP12 diminue la rétention cellulaire de RapaTAMRA, mais pas de TAMRA-PEG8-N3. Les diagrammes de dispersion de cytométrie en flux présentés sont représentatifs de trois répétitions indépendantes, qui sont résumées dans les graphiques à barres. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SD avec des points de données individuels. Le changement de pli est calculé comme le rapport entre les moyennes (sgRNA+/sgRNA−). Voir la Fig. 2 supplémentaire pour la stratégie de déclenchement.

(a, dérivés SLF ; b, dérivés FK506). Le tableau répertorie leur affinité pour le FKBP12 recombinant (test de polarisation de fluorescence) et leur efficacité à bloquer l'inhibition de mTOR par la rapamycine ou RapaLink-1 (évaluée par analyse Western blot du niveau de p-S6 après traitement des cellules MCF7 avec une combinaison de 10 nM de Rapamycine/Rapalink + 10 µM de composé candidat pendant 24 h. Le niveau de P-S6 est quantifié en tant que fraction du contrôle DMSO). ND, non déterminé. Les valeurs calculées de logP (cLogP) et de surface polaire topologique (tPSA) ont été calculées à l'aide de PerkinElmer ChemDraw 16.0. Les nombres de donneurs de liaisons hydrogène (HBD) et d'accepteurs de liaisons hydrogène (HBA) ont été déterminés à pH 7,4 à l'aide de ChemAxon Marvin Sketch 20.21. Le composé 06–039 est identique au composé 05–084 mais préparé dans un lot séparé. Le composé 06–041 est identique au composé 05–086 mais préparé dans un lot séparé.

GAPDH est un contrôle de chargement. Les données en (a) sont représentatives de deux expériences indépendantes. Les données en (b) proviennent d'une expérience avec n = 2 pour chaque condition de traitement. Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire.

a) Structures de RapaBlock et RapaBlock éthyloxime. b) L'oxime d'éthyle RapaBlock montre une affinité atténuée pour FKBP12 (n = 3, les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/− SD). c) L'oxime d'éthyle RapaBlock est moins puissant pour bloquer RapaLink-1. Les données sont représentatives de deux expériences indépendantes. Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire.

Les souris ont été traitées par voie intrapéritonéale avec une dose unique de RapaLink-1 (1 mg/kg), RapaBlock (40 mg/kg) ou une combinaison des deux. L'activité de mTOR a été stimulée avec de l'insuline (250 mU) 15 min avant la dissection des tissus. Le cerveau entier et le muscle squelettique ont été analysés par immunoblot. Les intensités de p-RPS6 et p-4EBP1 ont été quantifiées par densitométrie à l'aide des logiciels Silver Fast Scanner et ImageJ et présentées sous chaque immunoblot sous forme d'augmentation de pli par rapport au muscle ou au cerveau sans stimulation par l'insuline, normalisée à GAPDH. Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire.

a, des cellules U87MG exprimant la luciférase de luciole ont été injectées par voie intracrânienne à des souris BALB/cnu/nu. Après l'établissement de la tumeur, les souris ont été réparties en quatre groupes et traitées par des injections ip tous les 5 jours de véhicule, RapaLink-1 (1 mg/kg), RapaBlock (40 mg/kg) ou une combinaison de RapaLink-1 et RapaBlock (1 mg/kg et 40 mg/kg, respectivement). L'imagerie par bioluminescence de souris porteuses de tumeurs a été obtenue aux jours indiqués (le jour 0 était le début du traitement), en utilisant des conditions d'imagerie identiques. b, des cellules GBM43 exprimant la luciférase de luciole ont été injectées par voie intracrânienne à des souris BALB/cnu/nu. Après l'établissement de la tumeur, les souris ont été réparties en quatre groupes et traitées par des injections ip tous les 5 jours de véhicule, RapaLink-1 (1,2 mg/kg), RapaBlock (60 mg/kg) ou une combinaison de RapaLink-1 et RapaBlock (1,2 mg/kg et 60 mg/kg, respectivement). L'imagerie par bioluminescence de souris porteuses de tumeurs a été obtenue aux jours indiqués (le jour 0 était le début du traitement), en utilisant des conditions d'imagerie identiques.

a, Structure d'une sonde fluorescente FK-TAMRA. b, l'inactivation de FKBP12 diminue la rétention cellulaire de FK-TAMRA. Les diagrammes de dispersion de cytométrie en flux présentés sont représentatifs de trois répétitions indépendantes, qui sont résumées dans les graphiques à barres. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SD avec des points de données individuels. Le changement de pli est calculé comme le rapport entre les moyennes (sgRNA+/sgRNA−). Voir la Fig. 2 supplémentaire pour la stratégie de déclenchement.

a, Structures du Dasatinib et du FK-Dasatinib. b, modèle de travail proposé pour les inhibiteurs de kinase dépendant de FKBP. c, Inhibition des kinases Src, Csk et DDR2 par Dasatinib et FK-Dasatinib en l'absence ou en présence de protéine FKBP12 recombinante 10 µM complétée (n = 2, les données sont présentées sous forme de points individuels). d, Inhibition de la prolifération des cellules K562 par le Dasatinib et le FK-Dasatinib, en présence ou en l'absence de RapaBlock 10 µM (n = 3, les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SD). e, les cellules Jurkat ont été stimulées avec un anticorps anti-CD3 (OKT3) en présence de dasatinib, FK-dasatinib et/ou RapaBlock et analysées par immunoblot. COX IV est un contrôle de charge. Les données sont représentatives de deux expériences indépendantes. f, les cellules Jurkat ont été traitées par impulsions avec Dasatinib (100 nM) ou FK-Dasatinib (100 nM) pendant 1 h, puis les médicaments ont été lavés et les cellules ont été incubées dans un milieu sans médicament pendant différentes durées, stimulées avec un anticorps anti-CD3 (OKT3) pendant 5 min et analysées par immunoblot. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes. COX-IV est un contrôle de chargement. Pour les données de source de gel, voir Fig. 1 supplémentaire. g, inhibition de 476 kinases purifiées par Dasatinib (10 nM) ou FK-Dasatinib (10 nM) en présence de 10 µM de protéine FKBP12 recombinante (n = 1). Voir le tableau supplémentaire 1 pour une liste complète des données d'inhibition de la kinase. h, profilage de la kinase de Dasatinib (100 nM Dasatinib) ou FK-Dasatinib (100 nM) dans des cellules Jurkat à l'aide de la sonde d'occupation covalente XO44. Les résultats présentés sont représentatifs de deux expériences indépendantes.

a, Structures chimiques du Lapatinib et du FK-Lapatinib. b, Inhibition de l'activité EGFR et HER2 kinase par le Lapatinib et le FK-Lapatinib en l'absence ou en présence de protéine FKBP12 recombinante 10 µM complétée (n = 2, les données sont présentées sous forme de points individuels). c, Inhibition de la prolifération des cellules SK-BR3 par le lapatinib et le FK-lapatinib en présence ou en l'absence de RapaBlock 10 µM (n = 3, les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SD). d, les cellules SK-BR3 ont été traitées avec du Lapatinib, du FK-Lapatinib et/ou du RapaBlock pendant 1 h et analysées par immunoblot. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes. GAPDH est un contrôle de traitement d'échantillon. Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire.

a, Structures chimiques de Prostetin et FK-Prostetin. b, Inhibition de l'activité kinase MAP4K4(HGK) par le Lapatinib et le FK-Lapatinib en l'absence ou en présence de protéine FKBP12 recombinante 10 µM complétée (n = 2, les données sont présentées sous forme de points individuels).

Ce fichier contient des figures supplémentaires. 1 et 2, tableau supplémentaire 2 (tableau supplémentaire 1 fourni séparément) et notes supplémentaires 1 à 3 – voir la page de contenu pour plus de détails.

Résultats du profilage de la kinase du FK-dasatinib.

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Réimpressions et autorisations

Zhang, Z., Fan, Q., Luo, X. et al. Inhibition de mTOR restreinte au cerveau avec pharmacologie binaire. Nature 609, 822–828 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05213-y

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Reçu : 13 octobre 2020

Accepté : 09 août 2022

Publié: 14 septembre 2022

Date d'émission : 22 septembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-022-05213-y

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Nature (2022)

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