Spectrométrie de masse non ciblée - Plafond de verre Jiaxing Inc.

npj Science of Food volume 7, Article number: 21 (2023) Citer cet article

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Les produits fonctionnels probiotiques ont attiré l'attention en raison de leur popularité croissante. Cependant, peu d'études ont analysé le métabolisme spécifique des probiotiques dans le processus de fermentation. Cette étude a appliqué la métabolomique basée sur UPLC-QE-MS pour suivre les changements dans les métabolomes du lait au cours de la fermentation par deux souches probiotiques, Lacticaseibacillus paracasei PC-01 et Bifidobacterium adolescentis B8589. Nous avons observé des changements substantiels dans le métabolome du lait fermenté probiotique entre 0 et 36 h de fermentation, et les différences entre les métabolomes du lait à la période intermédiaire (36 h et 60 h) et au stade de maturation (60 h et 72 h) étaient moins évidentes. Un certain nombre de métabolites différentiels spécifiques à un point dans le temps ont été identifiés, appartenant principalement aux acides organiques, aux acides aminés et aux acides gras. Neuf des métabolites différentiels identifiés sont liés au cycle de l'acide tricarboxylique, au métabolisme du glutamate et au métabolisme des acides gras. Les teneurs en acide pyruvique, acide γ-aminobutyrique et acide caprique ont augmenté en fin de fermentation, ce qui peut contribuer à la qualité nutritionnelle et aux propriétés fonctionnelles du lait fermenté probiotique. Cette étude métabolomique au cours du temps a analysé les changements fermentatifs spécifiques aux probiotiques dans le lait, fournissant des informations détaillées sur le métabolisme des probiotiques dans une matrice de lait et le mécanisme bénéfique potentiel du lait fermenté probiotique.

La fermentation est un processus métabolique, dans lequel les matières organiques sont complètement décomposées sous l'action d'enzymes1. Le lait fermenté est l'un des aliments fermentés les plus importants, reconnu comme un aliment sain et un bon vecteur de probiotiques2. Les probiotiques sont largement distribués dans le tractus intestinal, la cavité buccale, l'appareil reproducteur féminin et même la couche muqueuse de la peau. L'intervention probiotique dans le lait fermenté est largement soutenue par les médecins, en particulier les gastro-entérologues du monde entier3. Il est de plus en plus évident que le lait fermenté probiotique confère divers avantages pour la santé aux consommateurs, tels que la réduction du cholestérol sérique, la stimulation des réponses immunitaires, l'amélioration de la santé intestinale, la prévention de divers cancers et l'atténuation des troubles cognitifs2. Ces effets peuvent être attribués à divers composants fonctionnels du lait fermenté probiotique, tels que les peptides, les polysaccharides, les acides gras, les acides organiques, les vitamines et l'acide γ-aminobutyrique (GABA)4. Lacticaseibacillus paracasei a été largement utilisé dans l'industrie alimentaire probiotique en raison de ses effets sur la santé. Les allégations de santé ne se limitent pas à la santé gastro-intestinale, mais également à l'immunité de l'hôte, et des preuves scientifiques récentes soutiennent son efficacité clinique sur le soulagement des maladies bucco-dentaires, telles que la parodontite et les caries dentaires5,6. Plus important encore, certaines souches de Lacticaseibacillus paracasei ont de bonnes caractéristiques de fermentation et peuvent être utilisées dans la fermentation des aliments6,7. Un autre groupe de bactéries bénéfiques sont les bifidobactéries. L'espèce Bifidobacterium adolescentis attire de plus en plus l'attention car il s'agit d'un composant important du microbiote intestinal humain qui est lié à la santé de l'hôte, comme le maintien d'un poids corporel sain8 et la prévention de la constipation9. Cependant, Bifidobacterium adolescentis est difficile à utiliser pour la fermentation en raison de sa faible viabilité10. Par conséquent, la fermentation composée de Bifidobacterium adolescentis avec d'autres souches ayant de bonnes performances de fermentation serait une option qui augmente sa viabilité en tant que probiotiques.

Certaines études antérieures ont étudié les changements dans les métabolomes du lait fermenté probiotique, mais la plupart des études ne se concentrent pas sur l'analyse de la fonction et du métabolisme spécifiques aux probiotiques dans le processus1,11. Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus sont les bactéries starter de base les plus couramment utilisées en combinaison avec des probiotiques pour produire une fermentation probiotique du lait10. Cependant, l'utilisation combinée de ces bactéries starter traditionnelles avec des probiotiques dans la fermentation rend difficile la distinction entre les effets biochimiques et le métabolisme spécifiques aux probiotiques de ceux des bactéries starter traditionnelles. Par conséquent, il serait intéressant d'étudier l'effet unique des probiotiques sur le métabolome du lait, ce qui donnerait un aperçu du métabolisme spécifique aux probiotiques. De plus, des changements de maturation dans le métabolome du lait des produits probiotiques peuvent se produire en raison de l'action physiologique continue des microbes viables même après la fin de la fermentation. Ceci est particulièrement important dans les produits probiotiques, car une viabilité élevée des bactéries probiotiques pendant et après la fermentation est cruciale pour leurs effets bénéfiques. Cependant, les études précédentes n'analysent généralement que les changements de maturation sans se concentrer sur la surveillance des changements de métabolites au cours du processus de fermentation du lait, ce qui refléterait également la qualité et la stabilité du produit11,12.

Cette étude a appliqué deux souches probiotiques dans la fermentation du lait, à savoir Lacticaseibacillus paracasei PC-01 (PC-01) et Bifidobacterium adolescentis B8589 (B8589). La souche PC-01 a été isolée à partir de lait de yak naturellement fermenté. En raison de ses bonnes caractéristiques de fermentation et de probiotiques, il a été appliqué avec succès dans la production de lait fermenté13. La souche B8589 a été isolée de l'intestin d'un nourrisson en bonne santé ; et il a de bons effets anti-inflammatoires et régulateurs du microbiote intestinal14. De plus, notre étude précédente a révélé que l'utilisation combinée de PC-01 et de B8589 dans la fermentation du lait augmentait considérablement les niveaux de GABA et d'acides gras à chaîne courte dans le lait fermenté produit par rapport à l'utilisation de la souche PC-01 seule, ce qui améliore probablement sa fonction probiotique13. Par conséquent, cette étude visait à étudier plus avant les changements métabolomiques du lait au cours des processus de co-fermentation et de maturation du lait fermenté lorsque les deux souches étaient utilisées ensemble comme levain laitier. Les changements dans les numérations viables et la métabolomique du lait ont été surveillés par cytomètre en flux et métabolomique non ciblée, respectivement (Fig. 1).

Le lait pasteurisé a été co-fermenté par deux souches probiotiques, Bifidobacterium adolescentis B8589 et Lacticaseibacillus paracasei PC-01. Des échantillons ont été prélevés toutes les 12 h de fermentation jusqu'à ce que le pH atteigne 3,8 après 72 h. Le nombre de probiotiques viables dans le lait fermenté a été dénombré par cytométrie en flux. Les métabolomes du lait (à 0, 36, 60 et 72 h) ont été détectés par chromatographie liquide ultra-performante pour suivre l'évolution des métabolites et des voies métaboliques d'intérêt au cours de la fermentation du lait. Enfin, une analyse d'enrichissement a été réalisée sur les voies métaboliques différentielles identifiées.

Le nombre de cellules viables du lait fermenté probiotique a été détecté à différents moments de la fermentation à l'aide de la cytométrie en flux (Fig. 2A). Le nombre de cellules viables a atteint un pic à 36 h de fermentation (1,57 × 1010 UFC/mL), ce qui était significativement plus élevé qu'à 0 h (8,49 × 107 UFC/mL ; P < 0,001). Elle a diminué significativement à 8,87 × 109 UFC/mL à 60 h (P < 0,001) et a augmenté à 1,57 × 1010 UFC/mL à 72 h (P < 0,001).

A Modifications du nombre de cellules viables dans le lait fermenté probiotique. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± SD. ***P < 0,001. Les différences de nombre de microbes viables entre les points dans le temps ont été évaluées à l'aide de l'ANOVA au seuil de signification de 95 % (P < 0,05). B Diagramme de score d'analyse en composantes principales des métabolomes du lait à différents moments, c'est-à-dire 0, 36, 60 et 72 h de fermentation. Échantillons de contrôle qualité QC.

Une métabolomique non ciblée (basée sur UPLC-QE-MS) a été réalisée sur les échantillons de lait fermenté probiotique prélevés à 0, 36, 60 et 72 h. Pour améliorer l'interprétabilité et valider nos données, une analyse en composantes principales et une analyse discriminante orthogonale des moindres carrés partiels (OPLS-DA) ont été effectuées pour visualiser les changements dans le métabolome du lait à différents moments. L'analyse en composantes principales est un algorithme d'apprentissage automatique non supervisé qui reflète la variabilité globale entre les échantillons. Les axes x et y, respectivement, montrent les scores projetés des échantillons sur le plan composé des première et deuxième composantes principales, qui peuvent fournir une référence pour la similitude ou la différence entre les échantillons. Les symboles représentant des échantillons de 0, 36, 60 et 72 h ont montré une tendance de regroupement distincte basée sur le temps, et les échantillons de contrôle de la qualité se sont également regroupés étroitement en tant que groupe (Fig. 2B), ce qui suggère que la structure globale du métabolome du lait variait entre les points dans le temps, et que les conditions d'équipement et de chromatographie étaient stables et fiables.

Ensuite, des modèles OPLS-DA ont été utilisés pour identifier les métabolites marqueurs différentiels entre les points de temps (0 h contre 36 h ; 36 h contre 60 h ; 60 h contre 72 h). La modélisation OPLS-DA est basée sur la classification supervisée. Il filtre les variables orthogonales qui ne sont pas liées aux variables catégorielles des métabolites et analyse les variables non orthogonales et les variables orthogonales séparément, afin d'obtenir des métabolites différentiels plus fiables entre les groupes. Les tracés des scores des modèles OPLS-DA sont illustrés à la Fig. 3A – C. Encore une fois, une tendance de regroupement claire basée sur le temps est observée dans chaque comparaison par paires. De plus, les paramètres du modèle pour chaque groupe ont confirmé la validité et la précision des modèles (0 h versus 36 h : R2Y = 0,999, Q2 = 0,997 ; 36 h versus 60 h : R2Y = 0,992, Q2 = 0,983 ; 60 h versus 72 h : R2Y = 0,994, Q2 = 0,988).

Tracés de score d'analyse discriminante des moindres carrés partiels A – C orthogonaux et tracés de volcan D – F d'échantillons de lait fermenté. A, D 0 h contre 36 h ; B, E 36 h versus 60 h ; C, F 60 h contre 72 h. Les courbes de volcan illustrent les données de métabolomique du lait. Chaque point représente un métabolite détecté. Les métabolites significativement augmentés (Sig_Up) et diminués (Sig_Down) trouvés par comparaison par paires entre les échantillons sont indiqués en rouge et bleu, respectivement (seuil P < 0,05 et changement de facteur [FC] > 2 ou < 0,5). Les seuils significatifs sont marqués par les lignes pointillées noires dans les plots des volcans. Les métabolites différentiels entre les points dans le temps ont été évalués à l'aide de l'ANOVA au seuil de signification de 95 % (P < 0,05).

Les métabolites détectés sont visualisés dans des parcelles de volcan (Fig. 3D – F), et les seuils de coupure pour les métabolites marqueurs différentiels étaient le changement de facteur ˃2 ou <0, 05 et P <0, 05. Un total de 304 métabolites différentiels (151 augmentés et 153 diminués à 36 h par rapport à 0 h) ont été identifiés, dont 244 ont été identifiés par des recherches dans la base de données (tableau supplémentaire 1), dont 66 lipides et molécules apparentées aux lipides, 59 acides organiques et dérivés, 43 composés organiques de l'oxygène, 31 composés hétérocycliques d'organes, 13 phénylpropanoïdes et polycétides, 15 benzénoïdes et dix-sept autres métabolites. abolites. Cent dix métabolites différentiels ont été identifiés entre les métabolomes probiotiques du lait à 36 h et 60 h (43 augmentés et 67 diminués à 60 h par rapport à 36 h), et 79 de ces métabolites différentiels ont été identifiés par des recherches dans la base de données (tableau supplémentaire 1), dont 21 composés organiques de l'oxygène, 20 acides organiques et dérivés, 17 composés hétérocycliques d'organes, neuf lipides et molécules de type lipidique et 12 autres métabolites. Trente-six métabolites différentiels ont été identifiés entre 60 h et 72 h (24 augmentés et 12 diminués à 72 h par rapport à 60 h), et 27 de ces métabolites différentiels ont été identifiés par des recherches dans la base de données (tableau supplémentaire 1), dont sept lipides et molécules de type lipidique, neuf composés oxygénés organiques, cinq acides organiques et dérivés et six autres métabolites.

Nous avons ensuite classé les principaux métabolites différentiels par nature chimique afin de mieux comprendre le processus biochimique dans la production de lait fermenté probiotique (Fig. 4). Les quatre principaux types de métabolites différentiels appartenaient aux lipides et aux molécules de type lipidique, aux acides organiques et dérivés, aux composés oxygénés organiques et aux composés hétérocycliques d'organes, suivis des phénylpropanoïdes et des polycétides, des benzénoïdes, des alcaloïdes et des dérivés, etc. De toute évidence, différents profils métaboliques différentiels (à la fois dans la diversité et l'abondance des métabolites) ont été trouvés entre les points de temps (0 h contre 36 h ; 36 h contre 60 h ; et 60 h contre 72 h). Pour étudier plus en détail les changements biochimiques à différents stades de la fermentation du lait, nous avons effectué de manière sélective une analyse d'enrichissement des voies métaboliques sur trois principaux types de métabolites (c.

Les barres horizontales roses, vertes et bleues représentent le nombre de métabolites différentiels (écrits à côté/sur les barres) identifiés entre 0 h et 36 h ; 36h et 60h ; 60h et 72h respectivement.

L'analyse de l'enrichissement des voies métaboliques est un outil efficace pour élucider les mécanismes d'altérations métaboliques des échantillons. De 0 à 36 h, 25 voies métaboliques liées aux acides organiques et dérivés ont été identifiées, impliquant 17 métabolites différents (principalement des acides aminés et des acides organiques ; Fig. 5A et Tableau supplémentaire 2). Dix voies métaboliques liées aux lipides et aux molécules de type lipidique ont été enrichies, impliquant neuf métabolites différents (principalement des acides gras et des glycérophospholipides; Fig. 5B et tableau supplémentaire 2). Dix voies métaboliques liées aux composés organiques de l'oxygène ont été identifiées, impliquant 13 métabolites différents (principalement des glucides; Fig. 5C et tableau supplémentaire 2).

Comparaison entre (A–C) 0 h et 36 h ; J–V 36 h et 60 h ; et G–I 60 h et 72 h. Les voies enrichies sont liées aux acides organiques et dérivés (A, D, G), aux lipides et aux molécules de type lipidique (B, E, H) et aux composés oxygénés organiques (C, F, I), respectivement. L'échelle de couleurs représente la confiance de la différence significative (valeur P) entre les paires d'échantillons. Des voies métaboliques différentielles ont été détectées par le test de somme des rangs de Wilcoxon.

De 36 à 60 h, 17 voies métaboliques liées aux acides organiques et dérivés ont été identifiées, impliquant 6 voies différentes (principalement des acides aminés et des acides organiques ; Fig. 5D et Tableau supplémentaire 2). Trois voies métaboliques liées aux lipides et aux molécules de type lipidique ont été enrichies, impliquant deux métabolites différents de glycérophospholipides (figure 5E et tableau supplémentaire 2). Sept voies métaboliques liées aux composés organiques de l'oxygène ont été identifiées, impliquant sept métabolites différents (principalement des glucides ; Fig. 5F et tableau supplémentaire 2).

De 60 à 72 h, deux voies métaboliques liées aux acides organiques et dérivés ont été identifiées, impliquant un acide organique (Fig. 5G et Tableau supplémentaire 2). Deux voies métaboliques liées aux lipides et aux molécules de type lipidique ont été enrichies, impliquant deux métabolites différents (principalement des acides gras et des acides biliaires ; Fig. 5H et tableau supplémentaire 2). Six voies métaboliques liées aux composés organiques de l'oxygène ont été identifiées, impliquant cinq métabolites différents (principalement des sucres, des composés carbonylés et des alcools ; Fig. 5I et Tableau supplémentaire 2).

Cette étude a utilisé la métabolomique basée sur LC-MS pour étudier les changements métaboliques dans le métabolome du lait probiotique à différents moments au cours de la fermentation complexe par les souches bactériennes, PC-01 et B8589. En comparant les métabolites à différents moments, certains biomarqueurs différentiels significatifs ont été identifiés. Ces métabolites sont principalement des acides organiques, des acides aminés et des acides gras, qui sont impliqués dans des voies métaboliques importantes telles que le cycle de l'acide tricarboxylique (TCA), le métabolisme des acides gras et le métabolisme du glutamate (Fig. 6). Ces métabolites et les voies métaboliques auxquelles ils participent affectent non seulement la croissance et la reproduction des bactéries probiotiques dans l'environnement du lait, mais influencent également la saveur et les propriétés probiotiques du lait fermenté. Les voies métaboliques sont complexes et chaque voie peut se promouvoir ou s'inhiber via un mécanisme de rétroaction des métabolites produits. À notre connaissance, les interactions de certains des métabolites actuellement trouvés et leurs voies métaboliques/effets spécifiques associés dans la fermentation du lait n'ont pas été rapportées auparavant, ce qui mérite une enquête plus approfondie. Neuf métabolites spécifiques à l'étape de fermentation (acide succinique, acide pyruvique, acide l-glutamique, acide fumarique, GABA, acide caprique, acide oléique, acide palmitique, acide stéarique) ont contribué de manière significative à un métabolisme différemment enrichi (Fig. 6). Ces métabolites sont omniprésents dans le lait fermenté et sont importants pour sa qualité et ses propriétés sensorielles.

Les neuf métabolites (à savoir l'acide pyruvique, l'acide succinique, l'acide fumarique, l'acide l-glutamique, le GABA, l'acide palmitique, l'acide oléique, l'acide stéarique et l'acide caprique) sont écrits en noir sur la carte métabolique (panneau de gauche). Le graphique à barres horizontales (panneau de droite) montre que l'abondance relative de ces métabolites à différents moments de collecte d'échantillons, c'est-à-dire 0, 36, 60 et 72 h. CoA co-enzyme A, acide GABA γ-aminobutyrique, acide tricarboxylique TCA.

La plupart des métabolites différentiels sont des acides organiques. Les acides organiques les plus courants sont les acides carboxyliques (R-COOH) et leur acidité provient du groupe carboxyle (-COOH). Les acides carboxyliques à chaîne courte sont des facteurs chimiques importants affectant la saveur des produits laitiers. Ces acides proviennent de la lipolyse, du métabolisme des glucides et du métabolisme des acides aminés15. Les acides carboxyliques à chaîne courte biomarqueurs trouvés dans cette étude comprennent l'acide succinique, l'acide pyruvique et l'acide fumarique, qui sont générés dans le métabolisme des bactéries lactiques7,16,17.

Le pyruvate est formé en décomposant le glucose 6-phosphate formé après la phosphorylation du glucose par l'hexokinase18. C'est le produit final de la glycolyse, qui donne au yaourt un arôme d'acide acétique et un goût aigre agréable. Cette étude a trouvé une augmentation significative du pyruvate de 0 à 36 h, accompagnée de la croissance rapide des probiotiques lors de cette étape de fermentation. La croissance rapide des bactéries est probablement due à l'environnement initialement riche en glucose et à un anabolisme du pyruvate plus élevé que le catabolisme. À la fin de la fermentation, le glucose s'épuise et davantage de pyruvate est converti en d'autres métabolites en aval, ce qui ralentit la croissance bactérienne. Le pyruvate est également un précurseur de l'acétyl-CoA, un substrat important du cycle du TCA15. L'acide succinique et l'acide fumarique sont des intermédiaires du cycle TCA. L'acide succinique, avec ses goûts acides, salés et amers, est l'une des molécules de signalisation mitochondriales qui régule le stress oxydatif et les réponses inflammatoires dans les cellules19. L'acide fumarique est l'acide dicarboxylique insaturé le plus simple dans la nature avec un goût fruité aigre20. L'acide succinique peut être oxydé en acide fumarique par la succinate déshydrogénase19. Semblable au pyruvate, cette étude a trouvé une augmentation significative de l'acide succinique à 36 h. Cependant, la teneur en acide fumarique a continué à diminuer et n'a pas augmenté avec l'accumulation d'acide succinique. Cela peut impliquer que les bactéries probiotiques ont consommé de l'acide fumarique. Certaines bactéries lactiques (telles que Limosilactobacillus reuteri et Lacticaseibacillus casei) peuvent utiliser le cycle TCA dans le sens de la réaction de réduction, c'est-à-dire réduire l'acide fumarique pour former de l'acide succinique afin de favoriser la croissance bactérienne21. De plus, le fumarate ne s'accumule pas en excès au cours du métabolisme normal et il est rapidement catalysé par la fumarate hydratase pour générer du malate22. Nous avons en effet détecté l'acide D-malique comme métabolite différentiel, bien qu'il n'ait pas augmenté significativement à 36 h par rapport à 0 h. Cela peut être une autre raison de la baisse continue de l'acide fumarique.

Le métabolisme des acides aminés est étroitement lié au cycle du TCA, et les acides aminés sont également des produits importants du métabolisme des sources d'azote. Le l-glutamate et l'α-cétoglutarate relient le métabolisme des acides aminés et le cycle du TCA par la voie métabolique du GABA23. La voie métabolique du GABA est une branche dérivée du cycle TCA, qui est un processus dans lequel les micro-organismes décarboxylent directement et de manière irréversible le l-glutamate via la glutamate décarboxylase pour synthétiser le GABA24. Le GABA est un acide aminé non protéique à quatre carbones, qui a diverses fonctions, telles qu'abaisser la tension artérielle, effet anticonvulsivant, calmer les nerfs, améliorer le foie et les reins, renforcer la capacité antioxydante du corps, augmenter la tolérance à l'exercice, améliorer la fonction immunitaire et la capacité de reproduction25. Une voie de fermentation est la conversion microbienne du glutamate en GABA, qui est déclenchée par la diminution du pH pendant la fermentation26. Nos résultats ont montré une augmentation continue de la teneur en GABA, qui culminait en fin de fermentation, corrélée à l'acidification du lait fermenté. Dans le même temps, le GABA est également un facteur de croissance pour certaines bactéries, dont il a été rapporté qu'il favorise la croissance de probiotiques dans certains systèmes de fermentation24. Ceci est conforme à l'observation actuelle d'une croissance bactérienne active avec une haute viabilité des probiotiques. D'autre part, le glutamate confère un goût salé à des concentrations élevées27, et sa conversion en GABA par fermentation améliore la qualité sensorielle du lait fermenté probiotique.

Les acides gras sont généralement produits par des processus chimiques tels que la lipolyse, l'hydrolyse des protéines et la fermentation du lactose ; et le métabolisme des acides gras est lié au cycle du TCA via le substrat, l'acétyl-CoA11. Les acides gras améliorent non seulement le goût, la saveur et la texture du produit, mais ont également un impact physiologique sur les consommateurs. Le principal acide gras insaturé est l'acide oléique, qui représente 70 % du total des acides gras insaturés dans le lait fermenté28. L'acide oléique peut réguler les lipides sanguins, réduire le cholestérol et améliorer la sensibilité à l'insuline ; il peut également réduire le stress oxydatif et les réponses inflammatoires excessives chez les patients gravement malades29. Plusieurs études ont détecté des diminutions de l'acide oléique dans les produits laitiers pendant la fermentation11,30, ce qui est cohérent avec nos résultats. Notre étude a révélé que la teneur en acide oléique diminuait significativement après 36 h de fermentation, ce qui peut s'expliquer par la conversion de l'acide oléique en acide stéarique par hydrogénation11. En effet, nous avons observé une augmentation de l'acide stéarique à 36 h. Des études épidémiologiques ont montré que l'ingestion de divers acides gras a des conséquences biologiques différentes31. Des niveaux accrus d'acide stéarique ont été associés à une baisse de la tension artérielle, à une amélioration de la fonction cardiaque et à une réduction du risque de cancer32. Contrairement à la croyance populaire selon laquelle les acides gras saturés sont nocifs, l'acide stéarique semble avoir des effets bénéfiques sur la santé humaine, bien que le mécanisme moléculaire de ce phénomène ne soit pas encore clair31,33. Un autre acide gras couramment détecté dans le lait fermenté est l'acide palmitique, qui est généralement considéré comme malsain34. Cependant, la plupart des études n'ont analysé que l'effet d'une forte dose d'acide palmitique32,35, et une seule étude a démontré les effets apoptotiques et anticancéreux souhaitables de l'acide palmitique dans le lait fermenté probiotique36. Bien que les produits laitiers soient une source alimentaire importante d'acides palmitique et stéarique, leur consommation a été associée à un risque moindre de maladie cardiométabolique37. Ainsi, l'augmentation des acides palmitique et stéarique par la fermentation du lait pourrait être souhaitable, mais d'autres études seront nécessaires pour confirmer les effets sur la santé de ces métabolites. Nos résultats ont montré que le niveau d'acide caprique augmentait notablement à 36 h de fermentation et restait à un niveau élevé jusqu'à la fin de la fermentation. L'acide caprique est un acide gras à chaîne moyenne présent dans certains laits fermentés qui améliore l'épilepsie, stimule le métabolisme énergétique du cerveau et atténue le syndrome de malabsorption des nutriments38.

En conclusion, cette étude a généré des instantanés de la viabilité bactérienne et des métabolomes probiotiques du lait fermenté à différents moments pendant et après la fermentation du lait à l'aide de l'UPLC-QE-MS. Le métabolome probiotique du lait fermenté a beaucoup changé à des moments antérieurs (entre 0 et 36 h) et n'a montré que de légères différences pendant la période intermédiaire (entre 36 et 60 h) et la maturation (entre 60 et 72 h). Un certain nombre de métabolites différentiels ont été identifiés entre les différentes étapes de la fermentation probiotique du lait, comprenant principalement des acides organiques, des acides aminés et des acides gras, impliqués dans le cycle du TCA, le métabolisme du glutamate et le métabolisme des acides gras. Neuf métabolites différentiels ont été identifiés comme des biomarqueurs différentiels spécifiques à un moment donné, et leurs changements peuvent conduire à la qualité sensorielle et nutritionnelle unique du lait fermenté probiotique. Certaines biomolécules fonctionnelles, par exemple le pyruvate, le GABA et l'acide caprique, ont augmenté de manière significative à la fin de la fermentation, ce qui pourrait contribuer aux propriétés bénéfiques du lait fermenté probiotique. Cette étude métabolomique au cours du temps a analysé les changements fermentatifs spécifiques aux probiotiques dans le lait, fournissant des informations détaillées sur le métabolisme des probiotiques dans une matrice laitière.

Du lait écrémé en poudre (NZMP, Wellington, Nouvelle-Zélande) avec 2 % de glucose a été dissous dans de l'eau distillée (50 °C, 30 min). Le lait a été homogénéisé (65 °C, 20 MPa) et pasteurisé (95 °C, 5 min) avant d'être refroidi à 20 °C. Les souches bactériennes, B8589 et PC-01, ont été utilisées pour la fermentation complexe. Les deux souches étaient des probiotiques fournis par la Collection de cultures de bactéries lactiques, Université agricole de Mongolie intérieure, Chine. Les probiotiques ont été inoculés au lait écrémé pasteurisé refroidi et leurs comptes viables initiaux ont été ajustés à 1 × 107 UFC/mL pour PC-01 et 1 × 106 UFC/mL pour B8589, respectivement. Le lait inoculé a été soumis à une fermentation anaérobie à 37 °C jusqu'à ce que le pH atteigne 3,8 après 72 h. Après avoir atteint un pH de 3,8, le lait fermenté probiotique a été stocké à -80 ° C jusqu'à une analyse plus approfondie. Des échantillons de lait fermenté ont été prélevés toutes les 12 h pendant le processus de fermentation. La conception de l'étude est illustrée à la Fig. 1.

Le nombre viable de bactéries probiotiques dans le lait fermenté a été dénombré comme décrit précédemment39. Deux colorants, SYTO 9 (5 mM) et iodure de propidium (PI ; 1 mg/ml), ont été respectivement dissous dans du DMSO (≤ 1 %). Les échantillons de lait fermenté ont été dilués à la densité de 106 à 107 UFC/mL, et 980 μL d'échantillons de lait fermenté dilué ont été transférés dans quatre tubes propres. Dans trois des tubes, 10 μL de PI (0,2 mM/L ; PI simple coloration), 10 μL de SYTO 9 (0,1 mM/L ; SYTO 9 simple coloration) et 10 μL de colorants mixtes (SYTO 9, 0,1 mM/L ; PI 0,2 mM/L ; double coloration) ont été ajoutés, respectivement. Les quatre tubes à centrifuger ont été secoués pendant 30 s et incubés à température ambiante dans l'obscurité pendant 15 min. Des aliquotes d'échantillons à double coloration (200 μL chacun) ont été mélangées avec une quantité égale de microsphères de comptage absolu (Flow Counting Fluorescent Spheres; Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA) pour analyse sur un cytomètre en flux (MoFlo Astrios EQ Cell Sorter; Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA).

La source lumineuse du cytomètre en flux était un laser argon-ion refroidi par air (longueur d'onde de la lumière d'excitation à 488 nm ; longueur d'onde de la lumière d'émission > 630 nm). Pour chaque échantillon, les données de 500 000 cellules ont été recueillies. Des échantillons non colorés et des échantillons bactériens colorés par fluorescence PI ont été utilisés comme témoins. Des diagrammes de points de dispersion vers l'avant ont été dessinés et la porte R1 a été définie pour délimiter les cellules cibles. Un nuage de points avec 488-513/26-Height-Log en abscisse et 561-614/20-Height-Log en ordonnée a été établi pour délimiter le nombre de bactéries SYTO 9 positives et PI négatives. Un nuage de points avec 488-710/45-Height-Log comme coordonnée horizontale et 488-SSC-Area comme coordonnée verticale a été mis en place pour énumérer les microsphères de comptage absolu. Nombre total de bactéries = nombre de bactéries viables/nombre absolu de microsphères × nombre absolu de concentration de microsphères × taux de dilution.

Les échantillons (100 μL chacun) ont été mélangés avec 400 μL de solution d'extraction (acétonitrile : méthanol = 1:1, contenant un mélange d'étalon interne marqué isotopiquement) pendant 30 s dans des tubes Eppendorf. Les mélanges ont été soniqués pendant 10 min sur de l'eau glacée, laissés au repos à -4 ° C pendant 1 h et centrifugés à 4 ° C, 12 000 tr / min (force centrifuge 13 800 × g, rayon 8, 6 cm) pendant 15 min. Les surnageants d'échantillon ont été filtrés et transférés dans des flacons d'échantillons propres pour une analyse par chromatographie liquide ultra-performante (UPLC) avec un Acquity UPLC (Vanquish, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) couplé à Q Exactive HF-X Hybrid Quadripôle-Orbitrap Mass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Une colonne Acquity UPLC BEH Amide (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm) a été utilisée pour la séparation des analytes (Waters Corporation, Milford, MA, USA). Une quantité égale de tous les échantillons a été mélangée pour composer l'échantillon QC à analyser pour assurer la stabilité des conditions instrumentales et chromatographiques. Les phases de chromatographie liquide étaient : une phase aqueuse A, contenant 25 mmol/L d'acétate d'ammonium et 25 mmol/L d'eau ammoniacale ; la phase B était l'acétonitrile. Le gradient d'élution a été programmé comme suit : 0–0,5 min, 95 % B ; 0,5–7 min, 95–65 % B ; 7–8 min, 65–40 % B ; 8–9 min, 40 % B ; 9–9,1 min, 40–95 % B ; 9,1–12 min, 95 % B. La température du bac à échantillon était de 4 °C et le volume d'injection était de 2 μL. Le spectromètre de masse QE HFX a été utilisé pour sa capacité à acquérir des spectres MS/MS en mode d'acquisition dépendant de l'information (IDA) dans le contrôle du logiciel d'acquisition (Xcalibur, Thermo). Dans ce mode, le logiciel d'acquisition évalue en continu le spectre MS à balayage complet. Les conditions de la source d'ionisation électrospray ont été fixées comme suit : débit de gaz gaine de 3,35 L/min ; débit de gaz auxiliaire de 16,8 L/min ; la température capillaire de 350 °C ; plage de masse de 70 à 1050 ; Temps de scrutation/cycle de 760 ms ; pleine résolution MS de 60 000 ; Résolution MS/MS de 7500 ; énergie de collision de 10/30/60 en mode d'énergie de collision normalisée ; tension de pulvérisation de 3,6 kV (mode ions positifs) ou 3,2 kV (mode ions négatifs), respectivement.

Le fichier de données d'origine a été converti par le logiciel ProteoWizard au format mzXML. Un package R auto-écrit (noyau XCMS) a été utilisé pour traiter les données pour l'identification, l'extraction, l'alignement et l'intégration des pics, et une base de données MS2 interne (BiotreeDB) a été utilisée pour l'annotation des métabolites.

Les différences de nombre de microbes viables entre les points dans le temps ont été évaluées à l'aide de l'ANOVA au niveau de signification de 95 % (P <0, 05) en utilisant la version 4.0.4 de R (R Foundation for Statistical Computing, Vienne, Autriche). Les changements métabolomiques entre les points dans le temps ont été visualisés à l'aide de l'analyse en composantes principales et de l'OPLS-DA, qui ont été construits par l'outil en ligne Metaboanalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca). Les métabolites détectés ont été visualisés par des diagrammes de volcan et des caractéristiques métaboliques significativement différentielles ont été sélectionnées en fonction du changement de pli (changement de pli> 2 ou <0, 5) et de la valeur P ( P <0, 05). L'annotation des voies métaboliques et l'analyse de l'enrichissement des métabolites différentiels ont été réalisées à l'aide de la base de données Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html). Un diagramme schématique de la conception de l'étude a été construit par l'outil en ligne BioRender (https://app.biorender.com/).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Nous déclarons que toutes les données liées à cette étude sont incluses dans cet article et ses informations supplémentaires.

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Cette étude a été financée par la National Natural Science Foundation of China (32260572), les Inner Mongolia Science and Technology Major Projects (2021ZD0014), le fonds affecté à CARS-36 et le Major Project in Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region (n° 2020ZD12).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Yaru Sun, Shuai Guo.

Laboratoire clé de biotechnologie et d'ingénierie laitières (Université agricole de Mongolie intérieure), Ministère de l'éducation, 010018, Hohhot, Chine

Yaru Sun, Shuai Guo, Ting Wu, Jingwen Zhang, Lai-Yu Kwok, Zhihong Sun, Heping Zhang et Jicheng Wang

Key Laboratory of Dairy Products Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, 010018, Hohhot, Chine

Yaru Sun, Shuai Guo, Ting Wu, Jingwen Zhang, Lai-Yu Kwok, Zhihong Sun, Heping Zhang et Jicheng Wang

Inner Mongolia Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, 010018, Hohhot, Chine

Yaru Sun, Shuai Guo, Ting Wu, Jingwen Zhang, Lai-Yu Kwok, Zhihong Sun, Heping Zhang et Jicheng Wang

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YS : rédaction : ébauche originale, enquête, validation et visualisation. SG : rédaction : ébauche originale, enquête et validation. TW : enquête. JZ : enquête. L.-YK : rédaction—revue & édition. ZS : conceptualisation, enquête, rédaction—révision et édition. HZ : conceptualisation, enquête, rédaction—révision et édition. JW : conceptualisation, supervision et administration de projet.

Correspondance à Jicheng Wang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Sun, Y., Guo, S., Wu, T. et al. Une approche métabolomique basée sur la spectrométrie de masse non ciblée dévoile des changements biochimiques dans le lait fermenté probiotique composé pendant la fermentation. npj Sci Food 7, 21 (2023). https://doi.org/10.1038/s41538-023-00197-z

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Reçu : 09 décembre 2022

Accepté : 15 mai 2023

Publié: 24 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41538-023-00197-z

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